ניתוח ביטוי חלבונים מבוסס מערכי שלב הפוך: הליך לכימות סימולטני של ביטוי חלבונים מרובים מליזט התא

תקציר

מקור: O'Mahony, F. C. et al. The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) כדי לחקור שונות ביטוי חלבונים בתוך סרטן תאי כליה בודדים. J. Vis. Exp. (2013)

סרטון זה מדגים את המתודולוגיה לביצוע מערכי חלבונים בשלב הפוך (RPPA) לחקר דפוסי ביטוי חלבונים מליזט תא. ב- RPPA, הליזט המכיל תערובת של חלבונים מודפס על שקופיות ניטרוצלולוז וחלבונים מעניינים מנותחים באמצעות נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית.

פרוטוקול

1. הדפסת RPPA

1. ליזטים חלבוניים זוהו על מגלשות זכוכית מצופות ניטרוצלולוז (Fastslides-Whatman) באמצעות תצפיתן רובוטי MicroGrid II. השקופיות בהן נעשה שימוש הכילו 2 רפידות שעליהן אותרו הדגימות. כל פד אותר עם דגימות זהות, במקרה זה, 100 דגימות. פורמטים זמינים אחרים כוללים 1, 8 ו- 16 שקופיות פד. ככל שמספר הרפידות גבוה יותר, כך קטן מספר הדגימות שניתן לאתר על כל אחת מהן.
2. מכל דגימה נעשתה סדרה של חמישה דילולים של פי 2 וכל אחד מהם זוהה בטריפליקט (והתוצאה הייתה בסך הכל 15 נקודות לדגימה).

2. זיהוי חלבוני RPPA

1. שקופיות רטובות במאגר חוסם LiCor עודף (מדולל 50:50 ב-PBS). דגרו ב- RT במשך שעה על משטח נדנדה.
2. הכינו 800 μL של נוגדנים ראשוניים ב-LiCor Block Buffer (מדולל 50:50 ב-PBS) בריכוזים הרצויים ושמרו על קרח.
3. הרכיבו את השקופיות באחד מ-(i) תפס השבב של המסגרת הבודדת או (ii) מחזיק השקופיות 'FastFrame' בעל ארבעת המפרצים, כך שייווצר אטם הדוק בין השקופית לתא הדגירה.
4. הסר חיץ שיורי מבארות והוסף נוגדן ראשוני של 600 μL לבארות המתאימות.
5. הכניסו את המגלשה והתא לקופסה רטובה אטומה ודגרו על משטח נדנדה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
6. מהווים 0.1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 מ"ל PBS).
7. הסר שקופיות מהחדר הקר והסר בזהירות את הנוגדנים הראשוניים מכל באר.
8. הוסף 600 μL של PBS-T ושטוף שקופיות על משטח נדנדה ב- RT למשך 5 דקות (X3).
9. הכינו נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנטיות על ידי דילול ב-Odyssey Block Buffer (מדולל 50:50 ב-PBS) 0.01% SDS בדילול 1:2,000 (1 μL/2 מ"ל) במקרה הראשון.
10. הסר חיץ מבארות והוסף 600 μL נוגדנים משניים המסומנים באופן פלואורסצנטי לבארות המתאימות. לדגור נוגדנים משניים בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות עם רעד עדין; חשוב להגן על הממברנה מפני האור עד לסריקה סופית.
11. הסר נוגדנים משניים מהבאר ושטוף לזמן קצר (x3) ב 600 μL PBS-T בטמפרטורת החדר. הסר את המגלשה מהמנשא, העבר למיכל מתאים ושטוף בעודפי PBS-T למשך 15 דקות, תוך שמירה על הממברנה בחושך.
12. הסר PBS-T ושטוף עוד יותר את הממברנה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להסיר שאריות Tween-20, שוב לשמור על הממברנה בחושך.
13. יבשו את ה-Fastslide בתנור בטמפרטורה של 50°C למשך 10 דקות ולאחר מכן סרקו באמצעות סורק Li-Cor Odyssey. השאר את השקופית בחושך עד לסריקה.
14. סרוק את השקופית במהירות של 680 ננומטר ו/או 800 ננומטר, בהתאם לנוגדן/נוגדנים המשניים שבהם נעשה שימוש. לזיהוי בשני צבעים, השתמש תמיד בנוגדנים משניים צולבים מאוד כדי למזער תגובתיות צולבת. בחירה זהירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים נחוצה לזיהוי שני צבעים. חשיבות עליונה נודעת לבחירת מינים מארחים שונים (למשל ארנב ועכבר) עבור שני הנוגדנים הראשוניים. זה מאפשר הבחנה על ידי נוגדנים משניים נגד ארנבים ונגד עכברים אשר מסומנים בצבע עם ספקטרום פליטה קל להבחנה.
15. קובצי תמונה נשמרים כקובצי .tiff. איור 1 מתאר תמונה של קבצים סרוקים.

תוצאות

איור 1. דיאגרמת זרימה של תהליך סריקת RPPA.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריטון X-100	טריטון-X	T8787
Li-Cor Odyssey Block Buffer	לי-קור	927-40000
תצפיתן רובוטי MicroGrid II	ביורובוטיקה
מחזיק שקופיות ארבעה מפרצים של FastFrame	מה איש	10486001
מגלשה מהירה - 2-Pad	מה איש	10485317
IRDye 680LT עז נגד עכבר IgG	ליקור	926-68020
IRDye 800CW עז נגד ארנב IgG	ליקור	926-32211