מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לעובר דג זברה: טכניקה להעברת חומרים נפרוטוקסיים לזרם הדם של עובר דג זברה

תקציר

מקור: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection בדגי זברה כדי להדגים פגיעה חריפה בכליות. J. Vis. Exp.(2016)

סרטון זה מדגים מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לווריד הזנב של עובר דג זברה כדי לחקור את ההשפעות הכימיות שלהם על תפקוד הכליות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת פתרונות

1. הכינו תמיסת מלאי של 50x של מדיה עוברית E3 על ידי ערבוב 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl₂ ו- 9.95 גרם MgSO₄ ב- 5 ליטר מים מזוקקים, ואחסנו ב- RT.
2. הכינו תמיסת מלאי של 50x של מדיה עוברית E3 על ידי ערבוב 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl₂ ו- 9.95 גרם MgSO₄ ב- 5 ליטר מים מזוקקים, ואחסנו ב- RT.
3. לגידול עוברים של דגי זברה, דללו את תמיסת המלאי 50x של מלאי מדיה עוברית E3 לתמיסת עבודה 1x עם מים מזוקקים, ואז הוסיפו 200 μl של 0.05% methylene blue לכל 1 ליטר של 1x E3 כדי לשמש כקוטל פטריות, ואחסנו ב- RT.
4. הפוך פתרון חסימת פיגמנטציה של מדיה עוברית E3 עם 0.003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU) על ידי שילוב 40 מ"ל של מלאי 50x E3 עם 0.06 מ"ג PTU. לאחר מכן להביא את נפח סך של 2 L עם מים מזוקקים.
5. ערבבו את E3/PTU O/N ב-RT כדי להפוך את אבקת ה-PTU לתמיסה. לאחר מכן, אחסן את E3/PTU בכתובת RT.
   הערה: ל-E3/PTU חיי מדף של כשבוע, ופתרונות ישנים יותר יהיו פחות יעילים בחסימת התפתחות פיגמנטציה בזחלי דגי זברה.
6. צור תמיסת הרדמה של 0.2% טריקאין (MS-222) על ידי הוספת גרם אחד של טריקאין ל 500 מ"ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.2 עם 1 M Tris, pH 9.5.

2. הכנת כלים

1. הכינו כלי מניפולטור עוברים, המשמש למיקום עוברים למיקרו-הזרקה, על ידי הצמדת קצה העמסת ג'ל בקצה מחט חיתוך ישרה בגודל 5 אינץ', והדקו באמצעות נייר דבק או דבק-על.
2. הכינו מחטי מיקרו-הזרקה באמצעות מושך מחט, על ידי הכנסת תחילה זכוכית בורוסיליקט מלוטשת אש בקוטר 10 ס"מ עם חוט להט לתוך המכשיר ואבטחו את זכוכית הבורוסיליקט על ידי הידוק הידיות.
3. משוך את זכוכית הבורוסיליקט כדי לעצב מחטים מחודדות דקיקות. השתמש בהגדרות הבאות: חום 540, משיכה 245, מהירות 200 וזמן 125.
4. הניחו מחטים בתוך צלחת פטרי, תלו אותן על רצועה של חימר דוגמנות כדי להגן על קצות המחטים, ושמרו על הצלחת מכוסה כדי למנוע הצטברות אבק.
5. כדי לסיים להכין את המחט למיקרו-הזרקות, השתמש בסכין גילוח או בקצה מלקחיים עדינים כדי לחתוך את הקצה הנמשך של המחט כדי ליצור קצה הזרקה זוויתי חד בקוטר של כ-0.05-0.1 מ"מ.
6. להכנת מגש המיקרו-הזרקה, הכינו תמיסת אגרוז/E3 1.5% בבקבוק ארלנמאייר 100 מ"ל והמיסו את האגרוז על ידי חימום E3 לרתיחה במיקרוגל ואז הניחו להתקרר ב-RT למשך כ-10 דקות.
7. יוצקים את תמיסת האגרוז/E3 המקוררת לצלחת פטרי ליצירת מייקאפ בעומק של כ-0.5 ס"מ. כאשר זה התמצק יוצקים שכבה שנייה בעומק של כ 0.3 ס"מ ומכניסים את תבנית העובר הטרומית היטב ומאפשרים לאגרוז להתמצק ב RT.
   הערה: בעת הכנסת התבנית לשכבת אגר/E3 העליונה, מניחים את התבנית לתוך האגר בזווית כדי להקטין את מספר בועות האוויר.
8. לאחר שכל מגש המיקרו-הזרקה התייצב, הרימו היטב את העובר הטרומי עובש החוצה לאט ובזהירות באמצעות סקופולה, ולאחר מכן מלאו את הכלי בתמיסת E3 ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.

3. מיקרו-הזרקה של תמיסת נפרוטוקסין

1. ביום ההזרקה, הכינו את תמיסת הנפרוטוקסין הרצויה יחד עם בקרת הרכב המתאימה.
2. מערבבים או מערבבים בעדינות כדי לוודא שהתרופה נמצאת בתמיסה, תוך בדיקת צידי הצינור והחלק העליון של עמוד המים.
   הערה: פתרונות Nephrotoxin יכול להיות מוכן להכיל כמויות זעירות של דקסטרן מצומד פלואורסצנטית כדי לפקח על יעילות microinjection וגם להעריך פינוי כליות בנקודות זמן הבאות.
3. טען מחט מיקרו-הזרקה גזורה עם ~ 2-3 μL של הנפרוטוקסין על ידי השחלת קצה העמסת ג'ל דק לחלק האחורי של המחט והשהה את המחט אנכית עם חתיכת סרט כדי לאפשר לתמיסה למלא את קצה המחט החתוך על ידי כוח הכבידה.
4. ברגע שקצה המחט מלא, אבטח את המחט הטעונה במיקרומניפולטור.
5. בדוק את נפח המיקרו-הזרקה על ידי הנחת טיפת שמן מינרלי על מגלשת מיקרומטר והזריק לתוך השמן כדי להעריך את גודל הטיפה. נפח הזרקה של 500 pl יש קוטר של 0.1 מ"מ.
6. מוציאים את צלחת העוברים מהאינקובטור ומרדים על ידי הוספת כ-5 מ"ל של 0.2% טריקאין לצלחת העובר.
7. כדי להבטיח הרדמה מלאה, גע בעדינות בעובר עם קצה כלי מניפולטור העובר. חוסר תנועה מעיד על הרדמה מספקת.
8. לאחר הרדמה מוצלחת, מעבירים עוברים לתבנית ההזרקה עם פיפטת החזרה.
9. תמרנו כל עובר לתוך באר אחרת של התבנית, והציבו את הראש באזור העמוק ביותר של הבאר, כך שהגזע מונח לאורך השקע והזנב בולט החוצה מהשקע.
10. הכנס את המחט המלאה לתוך המיקרומניפולטור ומקם את קצה המחט ליד עובר.
11. הכנס בעדינות את המחט לכלי הזנב על ידי הזזת הג'ויסטיק קדימה ולחץ על דוושת כף הרגל כדי להעביר את המיקרו-הזרקה.
    הערה: הזרקה מוצלחת יכולה להימדד על ידי צפייה בנוזל נכנס למחזור הדם. יתר על כן, הזרקה משותפת של נפרוטוקסיקנט עם דקסטרן מצומד פלואורסצנטית מאפשרת לחוקר לוודא הזרקה מוצלחת לאחר ההליך.
12. משכו בעדינות את הג'ויסטיק כדי להסיר את המחט מהעובר.
13. לאחר ההזרקה, מעבירים את העוברים לכלי נקי ושוטפים כדי להסיר את הטריקאין ולהחליף ב-E3/PTU.
14. לדגור על העובר לנקודת הזמן הרצויה כדי להעריך מורפולוגיה, אשר ניתן לתעד על ידי צילום במדיה הרכבה מתילצלולוז, או תהליך לניתוח ניסיוני לפי הצורך.
    הערה: התאוששות העוברים צריכה להיות מוערכת כדי לקבוע את אחוז האנשים עם בצקת, אשר בדרך כלל מצביע על פגיעה כלייתית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי	ביואנליטי אמריקאי	AB01915
אשלגן כלורי	ביואנליטי אמריקאי	AB01652
מגנזיום סולפט	סיגמא-אולדריץ'	M7506
סידן כלורי	ביואנליטי אמריקאי	AB00366
N-פנילתיאוריאה (PTU)	אולדריץ' כימיה	P7629
אתיל 3-אמינובנזואט (טריקאין)	פלוקה אנליטית	A5040
זכוכית בורוסיליקט	סאטר אינסטרומנטס ושות'	BF100-50-10
מושך מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר אינסטרומנטס ושות'	Mo. P097
אגרוז אולטרה טהור	Invitrogen	15510-027
צלחות פטרי חד פעמיות בז, סטריליות, קורנינג:
60 מ"מ x 15 מ"מ	VWR	25373-085
100 מ"מ x 15 מ"מ	VWR	25373-100
מגש מיקרו-הזרקה 150 מ"מ x 15 מ"מ	VWR	25373-187
אינקובטור בטמפרטורה נמוכה	פישר סיינטיפיק	11,690,516DQ
פינצטה לניתוח מיקרו	רובוז כלי ניתוח ושות'	RS-5010
מיקרומטר	טד פלה, בע"מ	2280-24