הכנת הרכבה שטוחה לכליה: הליך לנתח ולהכין תושבת שטוחה לאנליזה מיקרוסקופית של כליה של דגי זברה בוגרים

תקציר

מקור: McCampbell, K. K. et al. ניתוח הרכב ותפקוד נפרון בכליה של דג זברה בוגר.J. Vis. Exp. (2014)

סרטון זה מדגים את הנתיחה וההכנה של תושבת שטוחה של הכליה של דג הזברה הבוגר. ניתן לדמיין את ההרכבה השטוחה שהוכנה תחת המיקרוסקופ לניתוח דגימה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דיסקציה והכנת כליה שטוחה של דג הזברה הבוגר מדגימת בעלי חיים לא קבועה כדי להמחיש תיוג דקסטרן פלואורסצנטי של הצינורית הפרוקסימלית

1. הרדימו את דג הזברה הבוגר המוזרק דקסטרן על ידי הכנסתו לצלחת עם 0.2% Tricaine pH 7.0 למשך 4-5 דקות.
   הערה: ודא כי הדג עבר המתת חסד לפני שתמשיך, על ידי מעקב קפדני אם הזימים הפסיקו לנוע והלב הפסיק לפעום.
2. בעזרת כף פלסטיק, מרימים את הדג מתמיסת הטריקאין, מרוקנים את התמיסה ומניחים את החיה על טישו או מגבת נייר.
3. השתמש בזוג מספריים חדים לדיסקציה כדי לבצע חתך מאחורי אופרקולום הזימים ולהסיר את הראש.
4. מיד לפתוח את הגוף של הדג עם מספריים דיסקציה על ידי ביצוע חתך הגחון ארוך מן הראש לבסיס של סנפיר קאודלי.
5. הסר את האיברים הפנימיים של הדג באמצעות זוג מלקחיים עדינים.
6. השתמש במחטי דיסקציה עדינות במיוחד כדי לפתוח את דפנות הגוף כדי לאפשר הדמיה של איבר הכליה, אשר נדבק לקיר הגבי של החיה.
7. השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק את הכליה מהדופן הגבית.
8. הכניסו בעדינות את הכליה לבקבוקון זכוכית של 5 מ"ל המכיל 1X PBS ושטפו 3 פעמים עם 3-5 מ"ל של 1X PBS טרי למשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: השימוש בבקבוקון זכוכית לטיפול בדגימות כליה בוגרות מאפשר הדמיה של הרקמה ומאפשר שטיפות בנפחים גדולים (יחסית למסת הרקמה) של כ-3-5 מ"ל. לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת תרבית תאים בת 12 בארות. בעוד שניתן להשתמש בצינור מיקרוצנטריפוגה מפלסטיק, הצינורות בגודל סטנדרטי (1.5 מ"ל) יכולים להגביל את הכביסה.
9. מוציאים את הכליה עם פיפטת העברה ומניחים על מגלשת זכוכית נקייה עם 1-2 טיפות של 1X PBS.
10. השתמשו במלקחיים עדינים, שטחו את הכליה במגלשה, וודאו שאף רקמה לא התעקמה או התהפכה על עצמה בדרך אחרת.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בכלי חוט טונגסטן כדי לבצע חתכים קטנים ברקמת החיבור כדי להקל על מיקום שטוח של הכליה.
11. הניחו חתיכות קטנות של חימר דוגמנות בכל פינה של כיסוי זכוכית בגודל 18 x 18 מ"מ והניחו את הכיסוי באיטיות על הכליה.
    הערה: יש לסובב מעט את הכיסוי בזווית קלה במהלך ההדבקה כדי למזער את בועות האוויר הלכודות בתמיסה. קוטר דיוות החרסית המידול הוא כ-2 מ"מ (איור 1A). לחילופין, ניתן להחליף דיווטים של שומן ואקום במקום חימר דוגמנות. הוסף טיפה נוספת של 1X PBS כדי למלא את החלל בין הכיסוי למגלשת הזכוכית במידת הצורך.
12. התבוננו ו/או דמיינו את הכליה על ידי הנחת מגלשת הזכוכית לשדה הראייה על סטריאומיקרוסקופ או מיקרוסקופ מורכב עם הפילטר המתאים.

תוצאות

איור 1. הכנה ויישום של דגי זברה בוגרים להרכבה שטוחה של כליות כדי להמחיש ספיגת דקסטרן מצומד במקטע PCT של נפרון כליות. (א)תמונת ברייטפילד של הכנת הרכבה שטוחה של דגימת כליה, שבה האיבר הוצב שטוח על מגלשת זכוכית, עם כיסוי המונח על גבי הרקמה הנשען על ארבע דיוות של חימר דוגמנות (צבע ורוד חם). כאן ההכנה הכלייתית מצולמת לצד סרגל מטרי כדי לספק השוואה מדורגת. אורכה של הכליה הבוגרת הטיפוסית הוא כ-5-7 מילימטרים (...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1X PBS			מיוצר על ידי דילול 10 X PBS במים מזוקקים.
מלקחיים עדינים	רובוז	RS-1050	תבנית פינצטה Dumont #55
שקופית זכוכית	תרמו-פישר	4445	כפור לבן
כיסוי זכוכית	תרמו-פישר	12-540א	18 x 18 מ"מ
דוגמנות חימר	הסברו	פליידו	ניתן להחליף חימר דוגמנות אחר ולעבוד באופן דומה.
מחזיק שקופיות	תרמו-פישר	12-587	אופציונלי: מגש קרטון לאחסון שקופיות שטוחות.
סטריאומיקרוסקופ	ניקון	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-כחול GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/ FITC; 83457 P-TRITC	ערכת המסננים בה נעשה שימוש הייתה כדלקמן: מסנן Hoechst/DAPI שימש לזיהוי DAPI, יודיד פרופידיום, כחול מפל דקסטרן ופוספטאז אלקליין. מסנן GFP/FITC שימש לזיהוי dextran-FITC, dextran lucifer yellow ו-antiGFP. מסנן TRITC שימש לזיהוי דקסטרן-פלואורו-רובי, PI ו-DBA.
מיקרוסקופ מורכב	ניקון	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C טקסס אדום	ערכת המסננים בה נעשה שימוש הייתה כדלקמן: מסנן Hoechst/DAPI שימש לזיהוי DAPI, יודיד פרופידיום, כחול מפל דקסטרן ופוספטאז אלקליין. מסנן GFP/FITC שימש לזיהוי dextran-FITC, dextran lucifer yellow ו-antiGFP. המסנן Texas Red שימש לזיהוי דקסטרן-פלואורו-רובי, PI ו-DBA.