דה-פיגמנטציה ושימור של כליה של דג זברה: טכניקה להכנת כליה של דג זברה בוגר להכתמה

תקציר

מקור: McCampbell, K. K. et al. ניתוח הרכב ותפקוד נפרון בכליה של דג זברה בוגר. J. Vis. Exp. (2014)

בסרטון זה אנו מדגימים את הפיגמנטציה של כליה של דג זברה בוגר ואת הכנתה לאחר מכן להליכי צביעה. לאחר הצביעה, הכליה של דג הזברה הבוגר יכולה לשמש לחקר התחדשות כליות, אפיון פנוטיפי של מודלים של מחלות כליות, ופונקציונליות נפרון.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. קיבוע, דיסקציה, חדירה והסרת פיגמנטציה של כליה של דג זברה בוגר

1. הכינו תמיסה מקובעת טרייה של 4% פרפורמאלדהיד (PFA)/1X PBS/0.1% DMSO או הפשירו אליקוט קפוא של 4% PFA/1X PBS והוסיפו 0.1% DMSO.
   זהירות: PFA הוא רעיל ויש לטפל בתמיסות PFA במכסה מנוע כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות וחלוק מעבדה. בנוסף, אבקת PFA צריכה להיות מטופלת בזהירות בעת ביצוע פתרון המלאי.
2. מלאו מגש דיסקציה בתמיסת קיבוע מספקת כדי לטבול את כל החיה.
3. הרדימו והרכיבו את דגי הזברה שנבחרו בתמיסת קיבוע.
   הערה: הדג שנבחר יכול להיות דג זברה לא מטופל, דגימת כליות או כליה שבודדה מדגי זברה שקיבלה בעבר זריקת דקסטרן תוך צפקית.
4. תקן את הדגימה O/N (12-16 שעות) ב 4 ^oC.
5. למחרת, השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק בזהירות את הכליה מדופן הגוף הגבי והכנס את האיבר לבקבוקון זכוכית באמצעות פיפטה העברה.
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בתרבית של 12 בארות או 24 בארות. בעוד שניתן להשתמש בצינור מיקרוצנטריפוגה מפלסטיק, הצינורות בגודל סטנדרטי (1.5 מ"ל) יכולים להגביל את הכביסה.
6. לשטוף את הכליה המנותחת 3 פעמים עם 3-5 מ"ל של 1X PBS עם 0.05% טווין במשך 5 דקות כל אחד.
7. הסר את 1X PBS עם 0.05% Tween ושטוף את הכליה עם 3 מ"ל של תמיסת 5% סוכרוז (ב 1X PBS) במשך 30 דקות.
8. יש להחליף ב-3 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז (ב-1X PBS) ולאחסן O/N (12-16 שעות) ב-4 ^oC.
   הערה: תמיסות הסוכרוז מחלחלות לקרומי התא, וכתוצאה מכך מאפשרות תיוג ספציפי של ריאגנטים כשהם חודרים לרקמה.
9. למחרת, להסיר את הפתרון 30% סוכרוז ולשטוף את הכליה 2 פעמים עם 5 מ"ל של 1X PBS עם 0.05% טווין במשך 5 דקות כל אחד.
10. החלף את PBS 1X עם 0.05% Tween עם 3-5 מ"ל של תמיסת הלבנה כדי להסיר פיגמנטציה מלנוציטים נוכח על איבר הכליה.
11. הניחו בקבוקון זכוכית על מסובב והתבוננו בזהירות כיצד הפיגמנטציה נעלמת.
    הערה: דה-פיגמנטציה נמשכת בדרך כלל כ-20 דקות כאשר היא מבוצעת לאחר טיפול בסוכרוז, אך לעיתים יכולה להימשך עד 60 דקות. אם פתרון ההלבנה נשאר על הכליה במשך זמן רב מדי, התפוררות של האיבר יכול להתרחש; מומלץ לעקוב אחר הדגימה כל 10-15 דקות כדי לבדוק את שלמות הרקמות.
12. כאשר הפיגמנטציה הוסרה מהכליה, יש לשטוף פעמיים עם 3-5 מ"ל של 1X PBS עם 0.05% טווין.
13. החלף את 1X PBS עם 0.05% Tween עם 3-5 מ"ל של 4% פתרון PFA למשך שעה אחת ב- RT.
14. הסר את תמיסת 4% PFA ושטוף את הכליה 3 פעמים עם 3-5 מ"ל של 1X PBS עם 0.05% טווין במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: לאחר השלמת הקיבוע, ניתן גם להרכיב את הכליה על מגלשת זכוכית ולהעריך ספיגת דקסטרן ללא פיגמנטציה של מלנוציטים.
15. הסר את PBS 1X עם 0.05% Tween והחלף עם 3-5 מ"ל של פתרון חוסם, ולאחר מכן לדגור את הכליה ב RT בבלוק במשך 2 שעות.
16. לאחר השלמת החסימה, המשך ישירות לפרוטוקול הצביעה שנבחר.
    הערה: כעת ניתן לעבד את הכליה באמצעות הליך אחד או יותר אחרים על מנת לבצע מחקרי תיוג עם ריאגנטים שונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1X PBS			מיוצר על ידי דילול 10X PBS במים מזוקקים
1X PBST			0.1% חומר ניקוי Tween-20 ב-1X PBS
1X PBS עם 0.05% טווין			0.05% חומר ניקוי Tween-20 ב-1X PBS
טווין 20	ביואנליטי אמריקאי	AB02038
4% PFA/1X PBS			להמיס 4% PFA (w/v) (מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים, Cat #19210) ב 1X PBS, להביא לרתיחה על צלחת חמה במכסה אדים. מצננים ומקפיאים את האליציטוטים לאחסון במקפיא בטמפרטורה של -20°C. מפשירים ממש לפני השימוש ולא מקפיאים מחדש את המלאי
פתרון הלבנה			נוסחת תערובת אקונומיקה (לתמיסה של 20 מ"ל): 1.6 מ"ל של תמיסת אשלגן הידרוקסיד 10% 0.6 מ"ל של 30% תמיסת מי חמצן 100 מיקרוליטר של 20% טווין ממלאים עד 20 מ"ל במים מזוקקים
אשלגן הידרוקסיד	סיגמא	221473
מי חמצן	סיגמא	H1009
פתרון חסימה			פתרון חסימה (לתמיסה של 10 מ"ל): 8 מ"ל של 1X PBS עם 0.05% טווין 2 מ"ל של סרום עגל עוברי 150 מיקרוליטר של DMSO