פתולוגיית הרחבה: שיטה להדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה של דגימות רקמה קליניות

תקציר

מקור: Klimas, A. et al. הדמיה ננוסקופית של קטעי רקמות אנושיות באמצעות התפשטות פיזית ואיזוטרופית.J. Vis. Exp.(2019)

בסרטון זה אנו מתארים שיטה הנקראת פתולוגיית התפשטות, גרסה של מיקרוסקופ התפשטות, שבה דגימות הרקמה הקלינית מורחבות כימית באמצעות רשת פולימרים לבדיקה מיקרוסקופית של מבנים ננומטריים.

פרוטוקול

1. פילמור באתרו של דגימות

1. לדגור על הדגימה בתמיסת עיגון.
   1. הכן את תמיסת העיגון (בדרך כלל 250 μL מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה) על ידי דילול תמיסת מלאי AcX ב- 1x PBS לריכוז של 0.03 מ"ג / מ"ל עבור דגימות קבועות עם קיבועים שאינם אלדהיד או 0.1 מ"ג / מ"ל עבור דגימות קבועות עם קיבוע אלדהיד, שיש להם פחות אמינים חופשיים זמינים להגיב עם AcX.
   2. מניחים את המגלשה בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ ומפיפטים את תמיסת העיגון מעל הרקמה. לדגור לפחות 3 שעות ב RT או לילה ב 4 °C (75 °F).
2. לדגור את הדגימות בתמיסת ג'לינג.
   1. הכינו לפחות פי 100 נפח עודף של תמיסת ג'לינג. לכל 200 μL, שלבו את הדברים הבאים, לפי הסדר: 188 μL של תמיסת מונומר, 4 μL של 0.5% תמיסת מלאי 4HT (דילול 1:50, ריכוז סופי: 0.01%), 4 μL של 10% תמיסת מלאי TEMED (דילול 1:50, ריכוז סופי 0.2%), ו-4 μL של 10% תמיסת מלאי APS (דילול 1:50, ריכוז סופי 0.2%).
      הערה: יש להכין את תמיסת הג'לינג מיד לפני השימוש. יש לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 4°C ולהוסיף את תמיסת ה-APS אחרונה, כדי למנוע ג'לינג בטרם עת.
   2. הסר את התמיסה העודפת מאזור הרקמה ומקם את המגלשה בצלחת פטרי 100 מ"מ. מוסיפים תמיסת ג'ל טרייה וקרה לדגימה ודוגרים על התערובת על הרקמה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C, כדי לאפשר דיפוזיה של תמיסה לתוך הרקמה.
3. בנו תא בשקופית סביב הדגימה (איור 1A) מבלי להפריע לתמיסת הג'לינג.
   1. הכינו ספייסרים לתא הג'לינג על ידי חיתוך דק של חתיכות זכוכית כיסוי באמצעות סכין יהלום.
      הערה: כדי להקל על הדמיה לאחר הרחבה, הספייסרים צריכים להיות קרובים בעובי לדגימת הרקמה כדי להפחית את כמות הג'ל הריק מעל הרקמה. זכוכית מספר 1.5 יכולה לשמש לדגימות קליניות סטנדרטיות (5-10 מיקרומטר). ניתן לערום חתיכות זכוכית כיסוי לקבלת דוגמאות עבות יותר.
   2. אבטחו את הספייסרים משני צדי הרקמה באמצעות טיפות מים (~10 μL).
   3. הניחו בזהירות מכסה זכוכית מעל המגלשה, והקפידו להימנע מלכידת בועות אוויר מעל הרקמה (איור 1B).
4. יש לדגור על הדגימה בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה (כגון צלחת פטרי סגורה עם מגבון לח) למשך שעתיים
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן את תא המגלשה בתוך צלחת פטרי אטומה ב -4 מעלות צלזיוס.

2. עיכול לדוגמה

1. הסר את מכסה תא הג'ל על ידי החלקת סכין גילוח בעדינות מתחת למכסה והרמה איטית של הכיסוי מעל משטח הג'ל. חתוך את הג'ל הריק סביב הרקמה כדי למזער נפח. חותכים את הג'ל באופן לא סימטרי כדי לעקוב אחר כיוון הג'ל לאחר הומוגניזציה, שכן הדגימה תהפוך שקופה.
   1. יש לדלל את ProK ביחס של 1:200 במאגר העיכול (ריכוז סופי: 4 U/mL) לפני השימוש. הכן פתרון מספיק כדי לטבול לחלוטין את הג'ל; באר אחת של צלחת תרבית תאי פלסטיק בעלת ארבע בארות דורשת לפחות 3 מ"ל לכל באר.
   2. לדגור את הדגימה במיכל סגור המכיל את מאגר העיכול במשך 3 שעות ב 60 ° C. אם הדגימה אינה מתנתקת מהשקופית במהלך העיכול, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר בעדינות את הדגימה.
      הערה: הדגימה צריכה להיות שקועה לחלוטין במאגר העיכול כדי למנוע מהדגימה להתייבש ולהניח אותה במיכל מכוסה (קופסת שקופיות קטנה, באר פלסטיק, צלחת פטרי וכו ') שניתן לאטום עם סרט.

3. הרחבת דגימה והדמיה

1. השתמש במברשת צבע רכה כדי להעביר את הדגימה לתוך PBS 1x במיכל תואם למערכת ההדמיה הרצויה וגדול מספיק כדי להכיל את הג'ל המורחב במלואו. ודא שהרקמה ממוקמת עם צד הדגימה כלפי מטה אם הדמיה על מערכת הפוכה או למעלה אם הדמיה על מערכת זקופה כדי למזער את המרחק ממטרת ההדמיה לדגימה. הפכו את הג'ל בעזרת מברשת צבע רכה במידת הצורך.
   הערה: ניתן להשתמש בתאורת צד מנורית LED כדי להפוך אותם לגלויים בנוזל. צלחת סטנדרטית בעלת 6 בארות יכולה להכיל דגימות בקוטר מורחב מראש של פחות מ-0.6 ס"מ. יש להשתמש בצלחת באר עם תחתית זכוכית לצורך הדמיה במערכת הפוכה.
2. שטפו את הדגימות ב-1x PBS ב-RT למשך 10 דקות. אם תרצה, הכתימו מחדש את הדגימה ב-300 ננומטר DAPI מכיוון שתהליך העיכול שוטף את כתם ה-DAPI. הסר PBS והכתים עם 300 ננומטר DAPI מדולל ב-1x PBS למשך 20 דקות ב-RT, ולאחר מכן שטיפה של 10 דקות עם 1x PBS ב-RT.
   הערה: ניתן לכסות את הדגימות ב-1x PBS ולאחסן אותן ב-4°C לפני שימשיכו לשלב הבא.
3. כדי להרחיב את הדגימות, החליפו את PBS ושטפו בנפח עודף של ddH₂O (לפחות פי 10 מנפח הג'ל הסופי) 3-5 פעמים למשך 10 דקות כל אחת, ב-RT.
   הערה: לאחר השטיפה^ה-3 או^ה-4, התפשטות הדגימה אמורה להתחיל להתייצב. לאחסון, כדי למנוע צמיחת חיידקים, ddH₂O ניתן להשלים עם 0.002%-0.01% נתרן אזיד (NaN₃). במקרה זה, גורם ההרחבה הסופי מופחת באופן הפיך ב -10%.
4. בצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי, מיקרוסקופ קונפוקלי או מערכת הדמיה אחרת לפי בחירה.
   הערה: כדי למנוע מג'לים להיסחף, ניתן להסיר נוזלים עודפים מהבאר. ג'ל יכול גם להיות משותק עם 1.5-2% אגרוז נמס נמוך. הכינו אגרוז בעל המסה נמוכה של 1.5-2% במים במיכל גדול פי 2-4 מנפח התמיסה. חממו את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס או במיקרוגל למשך 10-20 שניות כדי להמיס את התמיסה. פיפטה האגרוז המומס סביב שולי הג'ל. לאחר מתן אפשרות agarose להתקשות ב RT או 4 ° C, להוסיף מים לדגימה כדי למנוע התייבשות.

תוצאות

איור 1: תא גלציה לדגימות פתולוגיות. (A) שני ספייסרים, כגון שתי חתיכות של זכוכית כיסוי #1.5 חתוכה בסכין יהלום, ממוקמים משני צדי הרקמה לאחר הדגירה על הדגימה בתמיסת ג'לינג ב -4 מעלות צלזיוס. הספייסרים צריכים להיות עבים יותר מפרוסות הרקמה, כדי למנוע דחיסה של הדגימה. (B) מכסה, כגון חתיכת זכוכית כיסוי #1.5, משמש לכיסוי הדגימה לפני הדגירה ב 37 ° C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תחתונה זכוכית 6 בארות (#1.5 זכוכית כיסוי)	סלביס	P06-1.5H-N
אצטון	פישר סיינטיפק	A18-500
אקרילאמיד	סיגמא אולדריץ'	A8887
אקרילויל-X SE, (AcX)	Invitrogen	A20770
אגרוז	פישר סיינטיפק	BP160-100
אמוניום פרסולפט (APS)	סיגמא אולדריץ'	A3678	יוזם
DAPI (1 מ"ג/מ"ל)	תרמו סיינטיפיק	62248	כתם גרעיני
סכין יהלום מספר 88 ס"מ	כלים כלליים	31116
אתנול	פארמקו	111000200
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) 0.5 מטר	VWR	BDH7830-1
דגימת כליות FFPE	USBiomax	HuFPT072
מלקחיים
כיסוי מיקרו זכוכית #1 (24 מ "מ x 60 מ"מ)	VWR	48393 106
מיקרו כיסוי זכוכית #1.5 (24 מ "מ x 60 מ"מ)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)	סיגמא אולדריץ'	T9281	מאיץ
N,N′-מתילנביאסקרילאמיד	סיגמא אולדריץ'	M7279
תבשיל תרבית תאים 6 בארות Nunclon	תרמו פישר	140675
Nunc 15 מ"ל חרוטי	תרמו פישר	339651
Nunc 50 מ"ל חרוטי	תרמו פישר	339653
שייקר אורביטלי
מברשת צבע
מד pH
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 10x	פישר סיינטיפק	BP399-1
צלחת פטרי פלסטיק (100 מ"מ)	פישר סיינטיפק	FB0875713
פרוטאינאז K (כיתה ביולוגיה מולקולרית)	תרמו סיינטיפיק	EO0491
סכין גילוח	פישר סיינטיפק	12640
צינורות מיקרוצנטריפוגות Safelock 1.5 מ"ל	תרמו פישר	3457
צינורות מיקרוצנטריפוגה Safelock 2.0 מ"ל	תרמו פישר	3459
נתרן אקרילט	סיגמא אולדריץ'	408220
נתרן כלורי	סיגמא אולדריץ'	S6191
נתרן ציטראט טריבייסיק דיהידראט	סיגמא אולדריץ'	C8532-1KG
בסיס טריס	פישר סיינטיפק	BP152-1
טריטון X-100	סיגמא אולדריץ'	T8787
קסילן	סיגמא אולדריץ'	214736