$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. גישה פיפטה צידית לכליה מתחת לעמוד הדמיה נוזלי באמצעות הליך כירורגי חדשני
הערה: הרכבת מערכת התמיכה בהדמיה וההכנה לניתוח מוצגת באיור 1. ההליך המתואר מבוצע בעכברי C57BL/6 במשקל 20–25 גרם.
- שקלו את העכבר.
- יש להשרות הרדמה באמצעות 4% איזופלורן ולשמור עם 1.5-2.5% איזופלורן בתערובת אוויר/חמצן. אשר כי העכבר מורדם על ידי היעדר תגובה לגירוי כואב קצב נשימה מופחת.
- לשמן את העיניים ולמקם את החיה לרוחב על צלחת בסיס. לשתק 4 גפיים באמצעות קלטת.
- להזריק מלוחים רגילים, 200 μL, תת עורית ולהניח בדיקת טמפרטורה רקטלית. שליטה בטמפרטורה באמצעות מנורת חימום במהלך הניתוח וכרית חימום במהלך ההדמיה.
- הסר את כל השיער בצד שמאל של העכבר באמצעות קרם depilatory.
- אתר את הטחול, הנראה מתחת לעור, ואתר את הכליה השמאלית בצד הגבי והקאודלי של הטחול.
- בצע חתך של 0.5 ס"מ על העור וחתך קטן יותר על הצפק, בדיוק מספיק כדי שהכליה תעבור בקלות.
- להבליט את הכליה בלחץ עדין. מניחים את צורת מייצב הכליה העשוי מפוליסילוקסאן סביב הכליה ומקבעים עם דבק ציאנואקרילט. רפדו את הכליה עם הספייסר כך שהמשטח הצידי ביותר של הכליה משתרע מעבר למייצב בכ-1 מ"מ.
- מקבעים לוחית ראש לצורת המייצב עם דבק ומרכיבים את לוחית הראש למוטות הרכבה על לוח הבסיס.
- ממלאים את הבאר בתמיכה הפוליסילוקסנית המקיפה את הכליה בתמיסת אגרוז 1% ומניחים את מכסה ה-10 מ"מ מעל ומחזיקים עד שהאגרוז יציב. אטמו את הכיסוי לפלטת הראש עם דבק וצרו טבעת סביב הכיסוי עם מלט דנטלי.
- הזריקו FITC-דקסטרן (2,000,000 Da, 5% תמיסה, 100–150 μL) רטרו-מסלולית והזיזו את העכבר ואת לוחית הקיבוע לשלב המיקרוסקופ של 2 פוטונים במהירות, תוך שמירה על הרדמה והבטחת ניקוי נאות של גז פסולת בשלב המיקרוסקופ.
2. בחירת גלומרולוס ופיפטה מתאימים לחלל באומן
- הגדרות:
- הגדירו X כשמאל-ימין על המסך ושמאל-ימין מול המיקרוסקופ
- קרא SX (שלב X) מבקר הבמה
- הגדר PX כפיפטה X, בבקר חוגת פיפטה
- הגדירו את Y כמעלה-מטה על המסך וקדימה לכיוון המיקרוסקופ ואחורה לכיוון מערך 2 הפוטונים
- הגדירו את Z כמעלה לכיוון התקרה, מטה לכיוון הרצפה, ונמדדו על הבמה עם מיקום Z אובייקטיבי.
- הגדירו את S(O)Z כגובה הבמה (למעשה המטרה).
- מצא את פני השטח של הכליה, הניתנים לזיהוי באמצעות הגדרות מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בעין. בשל הזרקת FITC-Dextran, כלי הדם יהיה ירוק בהיר.
- זהה גלומרולוס מתאים. לאחר זיהוי פני הכליה באמצעות העין, עבור ל-2 פוטון (מצב לא סריקה) ובדוק את חלון ההדמיה. מאפיינים חיוביים עבור micropuncture הם כדלקמן: מרחק אנכי מתחת לכיסוי >30 מיקרומטר (כדי למנוע התנגשות בין פיפטה ו coverslip במהלך הגישה) ומרחק לרוחב מן הקפסולה הכליה לרוחב כדי glomerulus <400 מיקרומטר (מעבר למרחק זה סטייה של פיפטה עשוי להגדיל את הסבירות להחמצה).
- רשום מרחק רוחבי ואנכי לנקודת הניקוב, נקודה על קפסולת הכליה ישירות לצד פיפטה של גלומרולוס.
- הרם את נקודת המוקד האובייקטיבית לתוך עמודת המים, תוך שמירה על קואורדינטות שלב x ו- y ללא שינוי, רק כסנטימטר.
- הניעו את קצה הפיפטה לתוך עמוד המים והפעילו עירור 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). הזז את פיפטה במידות x ו- y עד לנקודה של פלואורסצנטיות מקסימלית של הקצה, זה יהיה מרכז המטרה. מציאת פיפטה בעין קשה ללא מילת יחס מדויקת זו. מאחר שנקודות קוונטיות פלואורסטיות באותו אורך גל (במקרה זה, אדום) ללא קשר לאורך גל העירור, עירור DAPI מייצר פלואורסצנטיות אדומה, אשר ממוקדת היטב בקצה, כפי שמודגם באיור 2.
- שנו את הגדרת העירור לחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) ודמיינו את פיפטה בעין, ואז מרכזו אותה במדויק בתצוגת העין.
- עברו ל-2 פוטונים ומצאו את פיפטה מתחת ל-2 פוטון, והציבו אותה בדיוק במרכז התמונה. זוהי עמדת הרישום.
- שמור תמונה של פיפטה.
- רשום את הבמה ואת קואורדינטות בקר המיקרופיפטה.
הערה: השתמש בקובץ .html המשלים, אשר יבצע חישובים באמצעות קוד JavaScript, (יתרון במערכות שאין בהן תוכנת גיליון אלקטרוני מותקנת) או גיליון אלקטרוני כדי לחשב את ההיסט בין קואורדינטות שלב ופיפטה ולחשב את קואורדינטות היעד עבור בקר הפיפטה.
- הסר את פיפטה מעמודת המים בציר x, תוך שמירה על z ו- y זהים.
- הזיזו את פיפטת Z ליעד גלומרולוס Z (כלומר, הזיזו את הפיפטה כלפי מטה בכיוון Z מתחת לכיסוי)
- הזז את פיפטה Y לקואורדינטת היעד glomerulus Y.
- העבר את התצוגה החיה של 2 פוטונים ליעד גלומרולוס Z ולאחר מכן לקצה הכליה ושים לב ל- SX.
- חשב את PX קצה הכליה באמצעות ההיסט מה- SX הרישום.
- הזיזו את השלב לכיוון הפיפט (הגדילו את ה-SX) כך שקצה הכליה יהיה רחוק משמאל למסך, אך עדיין גלוי.
- מקדמים את הפיפטה במהירות לכ-100 מיקרומטר פחות מקצה הכליה PX שחושב לעיל.
- אתר את קצה הפיפטה, וקדם את הפיפטה לאט. הגדל את הרווח האדום וצפה בהיסטוגרמה של הפיקסלים האדומים (התפלגות הפיקסלים משתנה לפני שהפיפטה מצולמת בחלון, עקב הבהירות הקיצונית של נקודות קוונטיות ופלואורסצנטיות מחוץ למטרה).
- התקדמות לקצה הכליה תחת הדמיה חיה של 2 פוטונים.
הערה: לפני הכניסה לקופסית הכליה, ניתן להפנות את פיפטה בממדי Y ו- Z. עם זאת, זה עלול לשבור את קצה פיפטה. אמצעי שמרני יותר, אם פיפטה היא מחוץ למטרה, הוא לסגת בממד X עד 2 ס"מ, להפנות מחדש, ולאחר מכן לחזור בממד X לקצה הכליות. ברגע שהפיפטה נמצאת בתוך הרקמה, תנועה בכל ציר שאינו X מובילה לכיפוף פיפטה הדורש ניסיון רב כדי לעשות בו שימוש, ולעיתים קרובות מובילה לשבירה.
- הניעו את הפיפט בציר X באיטיות אל היעד העגמומי PX, ושימו עין על ה-SX. (כדאי לחזור מדי פעם לגלומרולוס כדי לראות אם הוא זז בכלל עם החדרת המיקרופיפטה).
- כאשר אתה נמצא במיקום הנכון, מיקום המסמך עם z-stack.
הערה: כאשר המיקרופיפטה במקומה, ניתן להזריק תרופות, חלבונים או נותבים פלואורסצנטיים, לשאוף נוזל לניתוח מאוחר יותר, או למדוד לחץ או מטען ביחס לאלקטרודה אחרת.
3. שאיפת נוזל מהחלל של באומן
- הגדר את המיקרו-משאבה להזריק 100 nL של perfluorodecalin במשך 2 דקות כדי להבטיח פטנט של פיפטה ולהפחית בלבול מחיבור פיפטה במהלך הכניסה. תמונה מחדש כדי להבטיח מיקום פיפטה.
- המתינו 4-6 דקות לסינון נוסף.
- הגדר את המיקרו-משאבה לשאוף עד 300 nL בקצב של עד 50 nL/min.
הערה: שינויים במורפולוגיה גלומרולרית אינם נצפים בקצב זה, דבר המצביע על כך שהוא אינו משנה את קצב העברת הנוזל לחלל במהלך השאיפה. מכיוון שאין גוש שמן כמו במיקרו-נקב קונבנציונלי, התאוששות של נפח זה, הנחוצה לספקטרומטריית מסות, יכולה לכלול חלק מהפרפלורודקלין המוזרק ואולי נוזל צינורי. עבור בדיקות כגון מדידות אלקטרודות רגישות ליונים, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית, תגובת שרשרת פולימראז ונקודות קצה רגישות אחרות, ניתן להשתמש בנפחים נמוכים יותר. אם ספקטרומטריית מסות אינה נקודת הקצה, ניתן להשתמש בשמן מינרלי ובטכניקות מיקרו-ניקור סטנדרטיות כדי למדוד את הנפח הנשאף לפני האחסון.
- תמונה שוב.
- משוך את פיפטה ושמור על הדגימה, הוספת מאגר TRIS ואחסון ב -80° לפני הניתוח.
- המתת חסד העכבר באמצעות מנת יתר של isoflurane או שיטה מאושרת אחרת.
הערה: הסינון נכנס לחלל על ידי סינון מהנימים הגלומרולריים. קצב הסינון הגלומרולרי של נפרון יחיד (SNGFR) בעכברים מדווח בין 8-14 nL/min. עם זאת, כוחות זרזיר שולטים ב-SNGFR, ולחץ הידרוסטטי שלילי במרחב באומן עשוי לפיכך להגביר את SNGFR. שיטות מיקרו-ניקוב סטנדרטיות משתמשות בחסימה צינורית עם שמן ולחץ נייטרלי לדגימת נוזל צינורי, אולם תרכובות אלה מפריעות לספקטרומטריית מסות (ראה להלן); לכן, בטכניקה זו הצינורית הפרוקסימלית המוקדמת נשארת פטנט. יתר על כן, בזמן השאיפה, החלל של באומן מכיל נפח לא ידוע, אך חיובי של תסנין. לכן, קצב שאיפת נוזלים עשוי לחרוג SNGFR.
הערה: בניסויים המתוארים כאן, המטרה הייתה להשיג דגימה גדולה מהרגיל של תסנין גלומרולרי לניתוח ספקטרומטריית מסות בטכניקות ננו-פרוטאומיות. מכיוון ששימוש בספקטרומטריית מסות מונע שימוש בגושי שמן עם שמן מינרלי או שעווה (תערובות מורכבות של מולקולות אורגניות המפחיתות את האות: רעש בספקטרומטריית מסות), משתמשים בפרפלואורודקלין למילוי המיקרופיפטה והמזרק. פרפלורודקלין אינו ידוע כחוסם זרימה צינורית אך הוא אינרטי מבחינה ביולוגית ואינו מפריע לספקטרומטריית מסות.
