תרבית אורגנוטיפית של הכליה על עוף CAM: טכניקה להשתלת חצילים של כליות מורין על CAM עוף כדי לגרום להיווצרות של ארכיטקטורה וסקולרית כלייתית

תקציר

מקור: Kaisto, S. et al. אופטימיזציה של תרבית אורגנואידית ואורגנוטיפית של הכליה לכלי דם, התפתחות מורחבת והדמיית מיקרוסקופיה משופרת. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר שיטה לחקר התפתחות איברים באמצעות מערך משופר של השתלת קסנו-השתלה על קרום כוריאואלנטואי (CAM) מעוברי עופות. שיטה זו מאפשרת התפתחות של איברים עובריים ואורגנואידים בתרבית כלי דם מלאים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE

1. ייצור מיני-מאגרים לגידול כליות עובריות של עכברים ואורגנואידים כלייתיים על CAM עוף והקמת ניסויי השתלת קסנו

1. השתמש בתוספות תרבית תאים transwell המיועדות ללוחות 6 באר או 12 בארות.
   הערה: בהתאם לניסוי מסוים, מיני מאגרים גדולים או קטנים ניתן להשתמש. עדיף להשתמש במיני-מאגרים קטנים לקסנוגרפטינג של עד שמונה כליות עובריות או כאשר מספר מיני-מאגרים יונחו על אותו עובר תרנגולת (למשל, דגימות ניסוי ובקרה על אותו עוף CAM).
2. חתכו את דפנות התוספות באמצעות מולטיטול סיבובי עם להב מסור עגול או מסור ידני ליצירת טבעת פלסטיק בגובה 2 מ"מ עם קרום חדיר מחובר אליה.
3. לטש את הקצוות של מיני מאגרים אלה עם אזמל או סכין חדה.
4. לעקר את המאגרים הקטנים באתנול 70% למשך שעה אחת לפחות.
5. שטפו את המאגרים הקטנים במים מזוקקים כפולים ותנו להם להתייבש במכסה מנוע למינרי.
6. יש לשטוף את המאגרים הקטנים ב-PBS ובתרבית בינונית (DMEM עתיר גלוקוז/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין).
7. מניחים את המכל בצלחת פטרי, על גבי טיפה (600 μL/400 μL) של מדיום תרבית כאשר הממברנה פונה כלפי מעלה.
8. סדרו כליות עובריות ex vivo מנותחות או אורגנואידים כליות באופן שווה על הממברנה בעזרת פיפטה או צינור נימי זכוכית. הימנע משאיר הרבה נוזלים סביב הכליות.
9. תן לדגימות להיצמד לממברנה במשך 2-24 שעות באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   הערה: ניתן לסדר עד שמונה כליות עכבר עובריות E11.5 או אורגנואידים בכליות על התוספת הקטנה. התוספת הגדולה מומלצת אם חתיכות גדולות יותר של רקמה עוברית ישמשו להשתלת קסנו או תערובת תא-הידרוג'ל על שטח גדול יותר של CAM.
10. קחו לדוגמה תרנגולות עובריות מתורבתות בנות 8 ימים שהוכנו בשיטות שפורסמו בעבר מתוך אינקובטור תרביות התאים
11. העבירו את המיני-מאגרים ל-CAM כך שהשתלים פונים ל-CAM, והממברנה מכסה אותם. מקם את המאגרים הקטנים בשולי ה- CAM כך שלא יכסו את עובר התרנגולת.
    הערה: בעת שימוש במיני-מאגרים הקטנים יותר המיוצרים מתוספות טרנסוול עבור לוחות של 12 בארות, ניתן להציב עד שלושה מיני-מאגרים על מצלמת CAM אחת.
12. הוסף 500 μL (6-well insert) או 300 μL (12-well insert) של מדיום תרבית למיני-מאגרים.
13. לטפח את הדגימות על עוף CAM במשך מקסימום של 9 ימים. החלף את מדיום התרבית במיני-מאגרים מדי יום.
    הערה: וסקולריזציה של הדגימות ניתן לראות ברגע 24-48 שעות לאחר ההשתלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אינקובטור תאים	פנסוניק	13090543	טמפרטורה שנקבעה על 37° צלזיוס, 90% לחות, 5% CO₂
אינקובטור תאים	סאניו	10070347	חממת תרבות עוף CAM. טמפרטורה שנקבעה על 37° צלזיוס, 90% לחות, 5% CO₂
מדיום הנשר המעובד של דולבקו	סיגמא	D777	גלוקוז גבוה
אתנול (70%)	VWR
סרום בקר עוברי	הייקלון	SH3007003HI Thermo Scientific
מלקחיים DUMONT #5	דומונט	#5SF
PBS -/-	קורנינג	20-031-CV
PBS +/+	ביוווסט	X0520-500	שטיפת המאגרים הקטנים.
פניצילין וסטרפטומיצין	סיגמא	עמ' 4333
תוספות תרבית תאים דקיקות 12 בארות עם קרום פוליסטירן 0.4 מיקרומטר נקבוביות	גריינר ביו-וואן	665641
תוספות תרבית תאים דקיקות 6 בארות עם קרום פוליסטירן 0.4 מיקרומטר נקבוביות	גריינר ביו-וואן	657610