הזרקת Cisterna Magna כירורגית: שיטה למתן תאי גידול ישירות למערכת העצבים המרכזית של מודל Murine

תקציר

מקור: Law, V. et al. מודל Murine Ommaya Xenograft לחקר טיפול ממוקד ישיר במחלת Leptomeningeal. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה אנו מתארים את ההליך להעברת תאים סרטניים שמקורם בבני אדם לתוך עצם העצם במוחו של עכבר. מודל העכבר האורתוטופי יכול לשמש לחקר התפשטות גרורתית של סרטן לקרומי המוח הגולגולתיים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת CTCs

1. חשב את מספר CTCs הדרושים להזרקה והכן תרחיף חד תאי ב 1.0 × 10⁴ תאים / μL במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS). הניחו את תרחיף התא על קרח או בטמפרטורה של 4°C לאורך כל ההליך.
   הערה: בעת שימוש בקווי תאים הדורשים טריפסיניזציה, הקפד לשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי כדי להסיר טריפסין. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. אם משתמשים בקבוצה גדולה (>50 עכברים), ספרו מחדש את התאים ואמתו את יכולת קיום התאים בין הזריקות כדי להבטיח מתן מספר עקבי של תאים לכל עכבר.

2. הליך טרום ניתוחי

1. הזריקו לעכבר תת עורית 5 מ"ג/ק"ג buprenorphine sustained-release (Bup-SR).
   הערה: אין להזריק את אזור החתך המוצע; בחר אתר הזרקה הרחק מעצם השכמה.
2. מרדימים את העכבר עם 2-3% isoflurane עד שהוא לא מראה סימנים של רפלקס הנכון. בנוסף, בדוק את רפלקס צביטת הזנב ו / או הכפה, כדי לאשר את מצב ההרדמה.
3. הכן את העכבר לניתוח במיקום מרוחק מאזור הניתוח. יש לגזור את אתר הניתוח (כלומר, את המשטח הגבי של הגולגולת) עם שטח גבול מספיק כדי למנוע מהפרווה לזהם את אתר החתך; לאחר מכן, להרוות את האתר עם חיטוי עור germicidal, עובד ממרכז האתר לפריפריה, ולאחר מכן לאפשר לייבש. החל וילון סטרילי או חומר וילון פלסטיק סטרילי מגובה בדבק כדי להגן על אתר הניתוח מפני זיהום.
   הערה: יש לבצע אוטוקלאבים מראש ולעקר מחדש את הטיפים בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזי זכוכית.
4. לגלח את הפרווה של כל משטח הגחון של הראש ולהכין את העור באמצעות טכניקה סטרילית.
5. מקמו את האף עם חרוט אף בצורת L שונה של המנגנון הסטריאוטקטי, וודאו שהנרס נשאר ברור ופתוח. בעזרת נייר דבק על פני משטחי הגחון של שתי הפינות, משכו בעדינות את העור קדימה כדי להצמיד אותו לקונוס האף וכופפו את הצוואר בזווית של כ-90 מעלות לאחר ההצמדה. מתן איזופלורן 1.5% לשמירה על הרדמה.
   הערה: מיקום נכון יביא לכך שאזור החתך יוצג באופן המאפשר זיהוי קל של הרכס הקאודלי של עצם העורף.
6. מקמו את הגוף כדי להבטיח שעמוד השדרה נשמר ישר עם מגננת הסיסטרנה, ותוך כדי הפעלת משיכה קלה על הזנב, הניחו סרט דבק בבסיס הזנב כדי לאבטח.

3. הזרקת Cisterna Magna כירורגית

1. כאשר הצוואר בהארכה מלאה, ומתחיל ממש בין הפינה, הפעל את קצות המספריים הכירורגיים כלפי מטה בלחץ קל על פני עצם העורף.
   הערה: בעודו במצב קו אמצע זה, שקע קטן מורגש כאשר קצות המספריים טובלים באזור הקעור מעל מגנה cisterna.
2. בצע חתך קטן של 3-5 מ"מ בקו האמצע ממש מעל הקרום המישוש. צייר 5 μL של תרחיף תאים ב 1.0 × 10⁴ תאים/μL (סה"כ 5.0 × 10⁴ תאים) לתוך מזרק 30 גרם המילטון.
3. השתמש במלקחיים קהות עם קצוות של 1-2 מ"מ כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה על מגננת הסיסטרנה. הציגו טיפים במצב סגור ופתחו אותם תוך הפעלת לחץ כלפי מטה על הדורה.
4. חזור על דיסקציה קהה שתוארה בשלב הקודם עד לזיהוי קל של הקרום הדוראלי, וכלי הדם הקשורים נראים באזור החשוף.
   הערה: חלון ההזרקה שנוצר מבטיח שכלי הדם לא ייפגעו במהלך החדרת המחט.
5. בזמן שאתם מחזיקים את המלקחיים פתוחים כדי למשוך את השרירים שמסביב, הכניסו מחט 30 G ללא קורינג מתחת לדורה כדי לדמיין את השיפוע. ודא שהמחט מוחדרת רק מעבר לשיקוע עצמו. פרוס לאט בוכנה מזרק ולהעביר תאים ממש מתחת לדורה.
6. הניחו כראוי את השיפוע כדי להתבונן בזריקה מתחת לדורה. בזהירות לנהל את הטכניקה ולהשתמש מחט 30 G non-coring כדי למנוע נזק לממברנה ולהבטיח דליפה מינימלית. אם הבחינו בדליפה, הפעילו לחץ עדין עם מוליך צמר גפן.
7. סגור את העור על ידי מריחת קליפס פצע או מיקרו-טיפה של דבק עור. לאחר ביצוע ההזרקה בהצלחה, אפשרו לעכברים להתאושש מההרדמה על שמיכה חמה, והתבוננו בהם ברציפות עד שיוכלו לשמור על תנוחת עצם החזה ולהפגין תנועה תכליתית.
8. יש לעקוב אחר העכברים מדי יום לאחר הניתוח במשך השבוע הראשון. אם עכבר נראה סובל מכאב או מצוקה, טפל בו עם הזרקה תת עורית של 10 מ"ג / ק"ג של קרפרופן אחת ל -12 עד 24 שעות למשך עד 5 ימים בהתבסס על ייעוץ והנחיה וטרינרית. אפשר לעכברים להתאושש ולנטר אותם במשך 48 עד 72 שעות לפחות לפני שתמשיך לשלב הבא.
   הערה: Bup-SR, שניתן מראש, יימשך עד 72 שעות, ולכן משככי כאבים נוספים אינם נחוצים בדרך כלל. עם זאת, בעלי חיים יסופקו משככי כאבים נוספים לפי הצורך (אם רדום, לא אוכל, פרוע). אם אתר כירורגי מפתח סימנים של זיהום לאחר הניתוח (כלומר, אדמומיות, נפיחות, רגישות, אלודיניה, hyperalgesia, hyperpathia, או suppuration), או אם העכבר שומר על האזור הפגוע, להרדים את העכבר. אם תאים סרטניים מוזרקים בהצלחה לתוך CSF, LMD והתקדמות הגידול יתפתחו במערכת העצבים המרכזית תוך שבוע או שבועיים (תלוי בסוגי CTCs או קו התאים שבהם נעשה שימוש) (איור 1).

תוצאות

איור 1: הזרקה של תאים סרטניים במחזור הדם לתוך cisterna magna במודל של Murine xenograft כדי לחקור מחלות לפטומנינגיאליות וגרורות במערכת העצבים המרכזית. (A) איור המציג את מיקום ה-cisterna magna ואתר הגישה ל-CSF, שבו מזריקים CTCs באמצעות מזרק המילטון. (B) תמונת IVIS מייצגת של עכברים שפיתחו מחלת לפטומנינגה וגרורות במערכת העצבים המרכזית (במוח ולאורך חוט השדרה) לאחר שבועיים של הזרקה עם תאי גידול במחזור. התאים סומנו בגן כתב לוציפ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מעקר חרוזים	Braintree Scientific Inc. (או כל ספק)	#GER 5287-120V	נביטה 500
בופרנורפין שחרור מושהה (Bup-SR)	זופארם		נשלט על ידי DEA
מזרקי מיקרוליטר המילטון	המילטון		10, 25, 50 ו- 100 μL; 30G להזרקת cisterna magna
מלח חוצץ פוספט (PBS)	כל ספק		0.1 מ"מ מסונן סטרילי
כלי ניתוח מכרסמים (מספריים, מלקחיים)	Roboz Surgical Instrument (או כל ספק)
נייר כחול סטרילי/ כיסוי וילונות	כל ספק
מקלות כותנה סטריליים	כל ספק