הזרקה תוך-מוחית בעכבר: שיטת ניהול תרופות ישירה בתיווך אומאיה להעברת תרופות לחדרי המוח במוח עכבר

תקציר

מקור: Law, V. et al. A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct Targeted Therapy of Leptomeningeal disease. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים הזרקה תוך-מוחית בתיווך אומאיה במודל עכבר. השיטה מאפשרת אספקה מקומית של תרופות מועמדות פוטנציאליות וחומקת ממחסום הדם-מוח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הרכבה והשתלה של מורין אומאיה

1. הכנת התחנה
   1. יש לחטא את משטח התחנה. הניחו כיסוי כחול על פני השטח והכינו את כל הכלים והציוד המעוקר המצוין באיור 1.
2. הליך טרום ניתוחי
   1. החל שיכוך כאבים (Bup-SR) ושמור על סביבה כירורגית סטרילית.
3. השתלה כירורגית של מורין אומאיה
   1. הרכיבו את מכשיר ההזרקה Murine Ommaya באמצעות יציאת הזרקה מיניאטורית של 25G (קוטר חיצוני של 0.51 מ"מ) ודיסק ספייסר של 1 מ"מ. השתמשו בדבק סטרילי ציאנואקרילט כדי להבטיח חדירה של כ-2.5 מ"מ של צינורית המתכת לתוך חצי המוח הימני (איור 2A–C).
      הערה: אב טיפוס תואם MRI של Mouse Ommaya פותח במעבדה זו, שבה כבר שני החלקים (יציאת הזרקה זעירה וספייסר) מודפסים בתלת-ממד יחד כיחידה אחת (איור 2D). גרסת היחידה נבדקה על ידי MRI ויכולה לחסוך זמן על ידי ביטול שלב ההרכבה.
   2. מרדימים את העכבר עם 2-3% isoflurane עד שאין סימנים של רפלקס הנכון. יתר על כן, בדוק אם יש רפלקס צביטת זנב ו / או כפה כדי לאשר את מצב ההרדמה.
   3. מגלחים את כל משטח הגחון של ראש הפרווה ומכינים את העור בהתאם לטכניקה הסטרילית. מקם את העכבר במנגנון הסטריאוטקטי עם חרוט האף כדי להמשיך בניהול איזופלורן במהלך ההליך; להקטין את isoflurane ל 1.5%. הדקו בעדינות את מוטות האוזניים כדי לאבטח את הראש ומרחו חומר סיכה לעיניים כדי לכסות את עיני העכבר.
   4. בצע חתך עור קטן (3 מ"מ), ואחריו דיסקציה קהה של הרקמות התת עוריות הבסיסיות כדי לחשוף את הגולגולת. יבשו את הגולגולת באמצעות מקלות אפליקטור ספוגי מי חמצן מכותנה.
   5. קדח חור בור בגולגולת 0.5 מ"מ אחורי ו-1.1 מ"מ רוחבי של הברגמה – הנקודה האנטומית בגולגולת שבה התפר העטרתי מצטלב בניצב לתפר הקשת (איור 2A), כמו גם חור בור בקוטר 0.9 מ"מ כדי לחשוף את הדורה מאטר. הזיזו את המקדחה הצידה, והניחו בעדינות את העצם המקיפה את חור הבור לפני החדרת פתח הזרקה (עומק של כ-2.5 מ"מ), המודבק לגולגולת באמצעות דבק סטרילי ציאנואקרילט. מצב התפר סביב נקודת ההזרקה באמצעות 4-0 תפרי ניילון ללא ספיגה בתבנית תפר קטוע או תפר חוט ארנק.
   6. בית עכברים לאחר ניתוח בכלובים בודדים להתאוששות מניתוח.
      הערה: ייתכן שהאומאיה של מורין תרד כאשר עכברים רבים שהתאוששו מניתוח שוכנים באותו כלוב, אולי בגלל אינטראקציות חבלה בלתי פוסקות. מומלץ לשכן עכברים מושתלי מורין אומאיה בנפרד (או לא יותר מ-2 עכברים לכלוב) במהלך ניסוי יעילות התרופה.

2. טיפול במורין אומאיה

1. מינון עכברים באמצעות אומאיה מורין
   1. מרדימים את העכבר עם 2-3% isoflurane, עד שאין סימנים של רפלקס הנכון. יתר על כן, בדוק אם יש רפלקס צביטת זנב ו / או כפה כדי לאשר תחזוקה של הרדמה.
   2. גש ל- Murine Ommaya באמצעות מתאם הזרקת יציאה ומזרק המילטון. בעזרת מלקחיים, החזק את החלק העליון של יציאת ההזרקה הזעירה והכנס בעדינות את מתאם מזרק היציאה במלואו למחיצת היציאה.
      הערה: מזרק היציאה מנקב את מחיצת היציאה באופן שמקטין את השטח המת למינימום ומאפשר הזרקה מבוקרת באמצעות משאבת מזרק ממונעת (איור 3A). טיפולים ממוקדים/חדשניים מוזרקים בקצב זרימה של 1 מיקרוליטר/דקה בזמן ההרדמה. הטיפול יינתן בפרקי זמן מוגדרים (יומי/שבועי) למשך זמן מוגדר (שבועות/חודשים), בהתאם לשיקול דעתו של החוקר.
      נפח בין 3 ל -7 μL הוא אופטימלי, שכן נפח <3 μL אינו אמין, ונפח >7 μL עלול לגרום ללחץ רב מדי. גודלו של מזרק המילטון יכול לנוע בין 10 ל -100 מיקרוליטר, בהתאם למספר העכברים בכל זרוע טיפול. טעינה מראש של הנפח המתאים למזרק המילטון תמנע החלפה חוזרת של המזרק, ובכך תמזער טעויות. עדיף להקדיש מזרק המילטון אחד לכל זרוע טיפול.
   3. לאחר ביצוע ההזרקה, נתקו את ה-Murine Ommaya ממתאם הזרקת היציאה באמצעות מלקחיים, והחזירו את העכבר לכלוב כדי להתאושש מההרדמה.

תוצאות

איור 1: דוגמה להתקנה של תחנת עבודה לביצוע השתלת Murine Ommaya בעכברים. (1) מכונת הרדמה בגז/וופורייזר. (2) וילון נייר כחול סטרילי המכסה מעמד סטריאוטקסי. (3) מכשיר סטריאוטקסי (עמידה/במה, מוטות אוזניים, חרוט אף). (4) מיקרו-מקדחה. (5) זכוכית מגדלת באור. (6) מקלות אפליקטור סטריליים מכותנה עם מיכל שטיפה סטרילי של מי מלח. (7) מי חמצן. (8) מעקר חרוזים.

איור 2: השתלת מכשיר Murine...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דיסק ספייסר 1 מ"מ	Alzet, Durect Corporation	#0008670	דיסק מרווח בלבד
4-0 תפר ניילון אתילון	כל ספק
משאבות מזרק אוטומטיות	משאבות מזרקים של הרווארד (או כל ספק)	#70-4505	משאבה 11 עלית
מעקר חרוזים	Braintree Scientific Inc. (או כל ספק)	#GER 5287-120V	נביטה 500
בופרנורפין שחרור מושהה (Bup-SR)	זופארם		נשלט על ידי DEA
דבק סטרילי ציאנואקרילט	כל ספק
מערכת הרדמה בשאיפת גז	VeteEquip	#901812	COMPAC5
מזרקי מיקרוליטר המילטון	המילטון		10, 25, 50 ו- 100 μL; 30G להזרקת cisterna magna
מי חמצן	כל ספק
מערכת הדמיה IVIS 200	קליפר מדעי החיים
זכוכית מגדלת עם אור	כל ספק
מיקרו-מקדחה	סטולטינג (או כל ספק)	#51555M
הדמיית MRI	ברוקר	סדרת BioSpec	אופציונלי
אב טיפוס של Murine Ommaya (תואם MRI)	Instech מעבדות, Inc.	#VAB620-25MRI-3.3
מזרק PinPort	Instech מעבדות, Inc.	#PNP3M-50
פינפורט	Instech מעבדות, Inc.	#1-PNP3F28-50
כלי ניתוח מכרסמים (מספריים, מלקחיים)	רוביז כלי ניתוח (או כל ספק)
מכשיר סטריאוטקסי	סטולטינג (או כל ספק)	#51730M
נייר כחול סטרילי/ כיסוי וילונות	כל ספק
מקלות כותנה סטריליים	כל ספק