בדיקה מבוססת ביולומינסנציה תאית: שיטת תפוקה גבוהה לבדיקת תרופות קומבינטורית

Abstract

מקור: Hu, Z. et al. זרימת עבודה מהירה לסינון כדי לזהות טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל.J. Vis. Exp.(2021)

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה המדגישה את התועלת של בדיקת ביולומינסנציה לסינון רגיש ומהיר של תרופות. תרופות אלה ניתן לבדוק לבד או בשילוב כדי להעריך את הסינרגיזם במצב הפעולה שלהם.

Protocol

1. מדידה מבוססת ביו-לומינסנציה של כדאיות התא

1. ציפוי לוחות בתערובת מטריצה חוץ-תאית (ECM) (למשל, Matrigel): הוסף 40 μL של תערובת ECM 0.15 מ"ג/מ"ל לכל באר ודגר על הצלחת במשך שעה אחת ב-37°C. הסירו את עודפי תערובת ה-ECM ושטפו בעדינות פעם אחת עם PBS.
2. הוסף מדיום תרבית של 100 μL המכיל 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000 ו- 500 תאי XG387-Luc יחד עם תווך ריק של 100 μL כבקרה לכל באר עבור 6 עותקים משוכפלים בלוח תחתון אופטי של 96 בארות ותגדל את התאים למשך הלילה ב- 37 ° C.
3. הסר את supernatant, להוסיף 50 μL מדיום תרבית המכיל 150 ng / μL D-luciferin לתוך כל באר לדגור את התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C.
4. צלם תמונות של הביו-לומינסנציה התאית בלוח באמצעות מערכת ההדמיה IVIS spectrum. השתמש בתוכנה המובנית כדי ליצור אזורים מעגליים מרובים של אזור העניין (ROI) ולכמת את הביו-לומינסנציה התאית.

2. טיפול בטמוזולומיד והקרנה משולבת

1. צפו מראש ארבע פלטות 96 בארות כמתואר לעיל בשלב 1, לפני הטיפול.
2. זרעו תאי XG387-Luc בצפיפות של 1,000 תאים בתווך תרבית של 100 מיקרוליטר לכל באר של לוח תחתון אופטי של 96 בארות ותרבבו את התאים במשך הלילה.
3. הכינו מראש את הטמוזולומיד ואת סוכני היעד מתמיסת המלאי. הכינו סדרת ריכוזים המורכבת מ-800 מיקרומטר, 600 מיקרומטר, 400 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, 100 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר טמוזולומיד בתווך תרבית לטיפול בסוכן יחיד. לדלל טמוזולומיד ואת החומרים הממוקדים בתמיסת מלאי במדיום התרבית, בהתאמה, כדי להשיג ריכוזים סופיים של 200 מיקרומטר ו -2 מיקרומטר לבדיקת תרופות משולבות (רשימת חומרים).
4. הסר את מדיום התרבית כאשר רוב ה- GSCs נצמדים לתחתית הצלחות; הוסף את המדיום שהוכן לעיל המכיל טמוזולומיד לכל באר לקבלת שלושה עותקים טכניים לכל טיפול.
5. כדי לטפל בטמוזולומיד ולסנן את שילובי התרופות, הסר את התווך הריק והוסף את המדיום שהוכן לעיל המכיל 200 מיקרומטר טמוזולומיד, או 2 מיקרומטר סוכן ממוקד, או שילוב של שניהם לתוך כל באר עבור שלושה עותקים טכניים לכל טיפול.
6. לדגור על כל הצלחות ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 3 ימים.
7. הסר את המדיום המכיל תרופה, הוסף 50 μL מדיום ריק המכיל 150 ng / μL D-luciferin לתוך כל באר לדגור את התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C.
8. צלם תמונות של הביו-לומינסנציה התאית בלוח באמצעות מערכת ההדמיה IVIS spectrum. השתמש בתוכנה המובנית כדי ליצור ROI מעגלי מרובים ולכמת את הביו-לומינסנציה התאית.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	גיבקו	17504-044	פי 50
EGF	גיבקו	PHG0313	20 נ"ג/מ"ל
FGF	גיבקו	PHG0263	20 נ"ג/מ"ל
גלוטה מקס	גיבקו	35050061	פי 100
נוירובזל	גיבקו	21103049	פי 1
פניצילין-סטרפטומיצין	הייקלון	SV30010	P: 10,000 יחידות/מ"ל S: 10,000 מ"ג/מ"ל
נתרן פירובט	גיבקו	2088876	100 מ"מ
ABT-737	MCE		מעכב Bcl-2 Bcl-xL ו-Bclw סלקטיבי ומחקה BH3
אדאבוסרטיב (MK-1775)	MCE		מעכב Wee1
אקסיטיניב	MCE		מעכב טירוזין קינאז רב-ממוקד
AZD5991	MCE		מעכב Mcl-1
א 83-01	MCE		מעכב רב עוצמה של קולטן TGF-β מסוג I ALK5 קינאז
CGP57380	סלק		מעכב MNK1 חזק
דקטוליסיב (BEZ235)	סלק		מעכב ATPcompetitive PI3K ו-mTOR כפול
דסטיניב	MCE		מעכב טירוזין קינאז כפול ממשפחת Bcr-Abl ו-Src
ארלוטיניב	MCE		מעכב טירוזין קינאז EGFR
גפיטיניב	MCE		מעכב טירוזין קינאז EGFR
ליניפניב	MCE		מעכב מרובה מטרות ממשפחת VEGFR ו-PDGFR
מסיטיניב	MCE		מעכב c-Kit
ML141	סלק		מעכב לא תחרותי של Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		מעכב מרובה מטרות של Kit, KDR ו- CSF-1R
פלבוציקליב	MCE		מעכב CDK4 ו-CDK6 סלקטיבי
SB 202190	MCE		מעכב קינאז p38 MAP סלקטיבי
ספנטרוניום ברומיד (YM-155)	MCE		מעכב הישרדות
TCS 359	סלק		מעכב FLT3 חזק
UMI-77	MCE		מעכב Mcl-1 סלקטיבי
4-הידרוקסיטמוקסיפן (אפימוקסיפן)	סלק		אפנן קולטן אסטרוגן סלקטיבי (ER)