בידוד מבוסס SEC של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן במיקרוגליה: טכניקה לבידוד בועיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית מותנית במיקרוגליה

Abstract

מקור: Lemaire, Q. et al. אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי מערכת החיסון וחקר ההשפעה התפקודית על סביבת התא. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר שיטה המבוססת על כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות או כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מערכת החיסון במוח – תאי המיקרוגליה. כלי הרכב החשמליים פועלים כמטען מולקולרי כדי לספק מתווכים, המווסתים תגובה חיסונית. לכן, כלי הרכב החשמליים המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה לחקר הדיבור בין תאי עצב למיקרוגליה במהלך תגובה חיסונית עצבית.

Protocol

1. תרבית ראשונית של מיקרוגליה/מקרופאגים

1. תרבית ראשונית של מיקרוגליה
   1. מיקרוגליה ראשונית של חולדה מסחרית בתרבית (2 x 10⁶ תאים) (ראה טבלת חומרים) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת סרום ללא אקסוזום 10%, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, וגלוקוז 9.0 גרם / ליטר ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   2. אספו את המדיום המותנה לאחר תרבית של 48 שעות והמשיכו לבידוד של כלי רכב חשמליים.
2. תרבית ראשונית של מקרופאגים
   1. תרבית מסחרית של מקרופאגים ראשוניים של חולדות (1 x 10⁶ תאים) בתווך שסופק על ידי היצרן (ראה טבלת חומרים) ב 37 ° C ו 5% CO₂, עם סרום ללא אקסוזומים.
   2. אספו את המדיום המותנה לאחר תרבית של 24 שעות והמשיכו לבידוד של כלי רכב חשמליים.

2. בידוד כלי רכב חשמליים

1. בידוד מוקדם של כלי רכב חשמליים מתווך מותנה
   1. מעבירים את מדיום התרבית המותנית מתרביות מיקרוגליה או מקרופאגים (שלבים 1.1.2 או 1.2.2) לתוך צינור חרוט.
   2. צנטריפוגה במהירות של 1,200 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להניע את התאים.
   3. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי חדש. צנטריפוגה במהירות 1,200 x גרם למשך 20 דקות ב-RT לסילוק גופים אפופטוטיים.
   4. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור פוליקרבונט בנפח 10.4 מ"ל ומעבירים את הצינור לרוטור Ti 70.1. אולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך 90 דקות ב-4°C כדי להניע את כלי הרכב החשמליים.
   5. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה המכילה כלי רכב חשמליים ב-200 מיקרוליטר של 0.20 מיקרומטר מסונן של מלח חיץ פוספט (PBS).
2. בידוד כלי רכב חשמליים
   1. הכנת עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל תוצרת בית (SEC)
      1. רוקנו עמוד כרומטוגרפיה מזכוכית (אורך: 26 ס"מ, קוטר: 0.6 ס"מ) (ראו טבלת חומרים), שטפו ועיקרו.
      2. מקם מסנן של 60 מיקרומטר בתחתית העמודה.
      3. ערמו את העמוד עם מטריצת בסיס סינון ג'ל אגרוז צולבת ליצירת פאזה נייחת בקוטר 0.6 ס"מ ובגובה 20 ס"מ.
      4. שטפו את הפאזה עם 50 מ"ל של PBS מסונן 0.20 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר במידת הצורך.
   2. הניחו את גלולת ה-EV התלויה מחדש על גבי השלב הנייח של עמודת ה-SEC.
   3. אסוף 20 שברים רציפים של 250 μL תוך המשך הוספת PBS מסונן של 0.20 מיקרומטר בחלק העליון של הפאזה הנייחת כדי למנוע התייבשות של העמודה. אחסן את השברים בטמפרטורה של -20°C במידת הצורך.
      הערה: ניתן לבצע אחסון ארוך יותר משבוע בטמפרטורה של -80°C כדי לשמור על שלמות הרכב החשמלי לצורך אנליזה מולקולרית.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חולדה, מקרופאגים ומדיום תרבית מיקרוגליה	יישומים סלולריים	R620K-100	אורגין תאים: תקין בריא Rat מח
מיקרוגליה ראשונית של חולדה	לונזה	RG535
ספארוז CL-2B	GE שירותי בריאות	17014001
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	A95765
אולטרהצנטריפוגה רוטור 70.1 Ti	בקמן קולטר	342184
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8769
חיץ פוספט מלוחים	Invitrogen	14190094	ללא סידן, ללא מגנזיום
צינורות צנטריפוגות פוליקרבונט	בקמן קולטר	355651
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
אקסו-FBS	אוזים	EXO-FBS-50A-1	FBS מדולדל אקסוזום
DMEM Gibco 41966029
צנטריפוגה	אפנדורף	5804000010
אינקובטור CO2	תרמופישר
pluriStrainer M/ 60 מיקרומטר	pluriSelect	43-50060
עמודת MonoP FPLC	GE שירותי בריאות		כבר לא זמין