מאמר שיטה

מיצוי מבוסס SDS-PAGE של חלבונים הקשורים לשלפוחיות חוץ-תאיות: הליך למיצוי חלבונים מכלי רכב חשמליים והכנתם לעיכול בג'ל

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Lemaire, Q. et al. אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי מערכת החיסון וחקר ההשפעה התפקודית על סביבת התא. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים את שיטת העיכול בג'ל SDS-PAGE למיצוי חלבונים משלפוחיות חוץ-תאיות או מכלי רכב חשמליים. לאחר בידוד, מקטעי החלבון המתקבלים יכולים לשמש לניתוח פרוטאומי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אפיון רכבים חשמליים

  1. ניתוח כתם מערבי
    1. מיצוי חלבונים
      1. בודד את כלי הרכב החשמליים לפי עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) וכמת באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA).
      2. יש לערבב 50 מיקרוליטר של חיץ RIPA (150 מ"מ נתרן כלורי [NaCl], 50 מ"מ טריס, 5 מ"מ אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית [EGTA], 2 מ"מ חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית [EDTA], 100 מ"מ נתרן פלואוריד [NaF], 10 מ"מ נתרן פירופוספט, 1% נונידט P-40, 1 מ"מ פנילמתאן סולפוניל פלואוריד [PMSF], מעכב פרוטאז 1x) עם דגימת EV (25 מיקרוליטר כתוצאה מריכוז EV על המסנן) במשך 5 דקות על קרח ל לחלץ חלבונים.
      3. סוניק במשך 5 שניות (משרעת: 500 W; תדר: 20 קילוהרץ), 3 פעמים על קרח.
      4. הסר פסולת שלפוחית על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 10 דקות, ב 4 ° C.
      5. אספו את הסופרנאטנט ומדדו את ריכוז החלבון בשיטת בדיקת החלבון ברדפורד.
    2. נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) וכתמים מערביים
      1. ערבבו תמציות חלבון (30 מיקרוגרם) עם מאגר דגימת Laemmli 5c (v/v).
      2. העמיסו את תערובת החלבונים על ג'ל פוליאקרילאמיד 12%.
      3. יש להעביר את החלבונים בג'ל עם מאגר TGS (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM Glycine ו-0.1% SDS), במתח של 70 V למשך 15 דקות ו-120 V למשך 45 דקות.
      4. מעבירים את החלבונים לקרום ניטרוצלולוז עם מערכת חצי יבשה במתח של 230 וולט למשך 30 דקות.
      5. הרוו את הממברנה למשך שעה אחת ב-RT עם חיץ חוסם (0.05% טווין 20 w/v, 5% אבקת חלב w/v ב-0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. יש לדגור על הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן חד-שבטי נגד הלם חום 90 (HSP90) של עכבר המדולל בחיץ חוסם (1:100).
      7. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBS-Tween (PBS, 0.05% Tween 20 w/v) למשך 15 דקות.
      8. לדגור על הממברנה במשך שעה אחת ב- RT עם חזרת עז מצומדת נוגדן IgG משני נגד עכבר מדולל בחיץ חוסם (1:10,000).
        הערה: בקרה שלילית מבוצעת באמצעות נוגדנים משניים בלבד.
      9. חזור על שלב הכביסה (שלב 1.1.2.7).
      10. חשוף את הממברנה באמצעות ערכת מצע הדבקה מערבית משופרת (ECL) של כימילומינסנציה (ECL) (ראה טבלת חומרים).

2. אנליזה פרוטאומית

  1. מיצוי חלבונים ועיכול בג'ל
    1. בודד את כלי הרכב החשמליים לפי עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) וכמת באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA). חזור על שלב 1.1.1 עבור מיצוי חלבון EV.
    2. בצע נדידת חלבונים בג'ל הערימה של ג'ל פוליאקרילאמיד 12%.
    3. תקן את החלבונים בג'ל עם Coomassie blue במשך 20 דקות ב- RT.
    4. הבלו כל חתיכת ג'ל צבעוני לחתוך אותו לחתיכות קטנות של 1 מ"מ3.
    5. שטפו את חתיכות הג'ל ברצף עם 300 מיקרוליטר מכל תמיסה: מים אולטרה-טהורים למשך 15 דקות, 100% אצטוניטריל (ACN) למשך 15 דקות, 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3) למשך 15 דקות, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) למשך 15 דקות, ו-100% ACN למשך 5 דקות עם ערבוב מתמשך.
    6. יבש לחלוטין חתיכות ג'ל עם רכז ואקום.
    7. בצע הפחתת חלבון עם 100 מיקרוליטר של 100 mM NH4HCO3 המכיל 10 mM dithiothreitol למשך שעה אחת ב-56°C.
    8. בצע אלקילציה של חלבון עם 100 μL של 100 mM NH4HCO3 המכיל 50 mM iodoacetamide במשך 45 דקות בחושך ב RT.
    9. שטפו את חתיכות הג'ל ברצף עם 300 מיקרוליטר מכל תמיסה: 100 מ"מ של NH4HCO3 למשך 15 דקות, ACN: 20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) למשך 15 דקות, ו-100% ACN למשך 5 דקות עם ערבוב מתמשך.
    10. יבש לחלוטין את חתיכות הג'ל עם רכז ואקום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוניטריל פישר כימיקלים A955-1
אמוניום ביקרבונט סיגמא-אולדריץ' 9830
נוגדן HSP90 α/β (RRID: AB_675659) סנטה-קרוז SC-13119
Bio-Rad חלבון Assay דיאגנט מגיב להתרכז (ברדפורד) ביו-ראד 5000006
Dithiothreitol סיגמא-אולדריץ' 43819
אתילן גליקול-ביס(2- אמינואתילטר)-N,N,N′,N′- חומצה טטראצטית סיגמא-אולדריץ' 03777-10G
חומצה Ethylenediaminetetraacetic סיגמא-אולדריץ' ED-100G
Fisherbrand Q500 Sonicator עם Probe פישרברנד 12893543
אידואצטמיד סיגמא-אולדריץ' I1149
כתם חלבון InstantBlue Coomassie אקספדאון ISB1L
Laemmli 2x ביו-ראד 1610737
נונידט P-40 פלוקה 56741
Peroxidase AffiniPure עז נגד עכבר IgG (H+L) ג'קסון מחקר חיסוני 115-035-003
Phalloidin-tetramethylrhodamine מצומדסנטה-קרוז SC-362065
מעכב פרוטאז סיגמא-אולדריץ' S8830-20TAB
נתרן כלורי שרלאו SO0227
סודיום דודציל סולפט סיגמא-אולדריץ' L3771
נתרן פלואוריד סיגמא-אולדריץ' S7920-100G
נתרן פירופוספט סיגמא-אולדריץ' S6422-100G
רכז ואקום SpeedVac תרמופישר
תא העברה יבש למחצה Trans-Blot SD ביו-ראד 1703940

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים