השתלת חלון הדמיה גולגולתי במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת כיסויים מבוססי זכוכית לגישה אופטית יציבה לאזורים במוח מורין

תקציר

מקור: Alieva, M. et al. הדמיה תוך-חיונית אורכית של התנהגות תאי גידול במוח בתגובה לביופסיה כירורגית פולשנית.J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מציג הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי במודל עכבר לגישה אופטית יציבה לאזורים שונים במוח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. השתלת תאי גידול והדמיית חלון הדמיית גולגולת

1. הכנה כירורגית
   1. יש להשתמש בעכברים בוגרים (בני >6 שבועות) מכל זן או מין. הרגיעו עכבר על ידי הזרקת פלואניזון [נוירולפטי] + פנטניל [אופיואיד]) (0.4 מ"ל/ק"ג) + תרופת הרגעה בנזודיאזפינים (2 מ"ג/ק"ג) במינון של 1:1:2 במים סטריליים. הערך את מצב ההרגעה של בעל החיים על ידי צביטת בוהן.
      הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 נקבות וזכרים כאחד בשל אותו רקע גנטי של קו תאי הגידול ששימש בניסויים אלה (GL261). העכבר יישאר מורדם לחלוטין למשך שעה וחצי. לחלופין, יש להשתמש בהרדמה אינהלטית כגון איזופלורן (תערובת איזופלורן 1.5%-2% איזופלורן/O₂).
   2. הרכיבו את העכבר על מסגרת סטריאוטקטית ואבטחו את הראש באמצעות מהדק אף ושני מוטות אוזניים.
   3. השתמשו במנורת חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. יש להשתמש במנורת חימום בזהירות, לחילופין ניתן להשתמש בכריות חימום למחזור מים.
   4. יש למרוח משחת עיניים כדי להגן על קרניות העכבר מפני ייבוש.
   5. השתמשו במספריים חדים כדי לגלח את הפרווה שעל הגולגולת (האזור הגבי מעיני העכבר ועד בסיס הגולגולת שלו) ולחטא את העור החשוף באתנול 70%.
   6. חותכים את העור בצורה מעגלית עם מספריים חדים ומגרדים את הפריאוסטאום שמתחתיו עם צמר גפן. יש למרוח טיפה של לידוקאין 1% + אפינפרין 1:100,000 למשך 5 דקות ולהסיר את העודפים בעזרת צמר גפן.
   7. מדביקים את קצוות העור לגולגולת עם דבק ציאנואקרילט.
   8. מקם את המסגרת הסטריאוטקטית תחת מיקרוסקופ סטריאו דיסקציה עם הגדלה פי 4.
   9. דמיינו את הגולגולת דרך מיקרוסקופ הדיסקציה וקדחו חריץ עגול בקוטר 5 מ"מ מעל עצם הקודקוד הימנית. בצע צעד זה בזהירות ורק באופן שטחי, הימנעות מכל לחץ על הגולגולת.
   10. יש למרוח טיפה של חיץ קליפת המוח (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM גלוקוז, 10 mM HEPES buffer, 2 mM MgSO₄ ו-2 mM CaCl₂ [pH 7.4]) ולהרים את דש העצם באמצעות מלקחיים דקים.
   11. עבור השלבים הבאים, שמור על משטח המוח מכוסה במאגר קליפת המוח, אלא אם כן צוין אחרת.
   12. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, דמיינו את פני השטח של המוח והסירו את הדורה מאטר באמצעות פינצטה מעוקלת, מחודדת ועדינה מאוד. אם הדימום מתרחש בשלב זה, השתמש בספוג ג'לטין נספג כדי לעצור אותו.

2. הכנת חלון הדמיה גולגולתית

1. הסירו את חיץ קליפת המוח והניחו טיפה של שמן סיליקון על אתר הקרניוטומיה כדי למנוע בועות אוויר מתחת לחלון.
2. אטמו את המוח החשוף עם כיסוי בקוטר 6 מ"מ. יש למרוח דבק ציאנואקרילט בין הכיסוי לגולגולת. לחץ בעדינות על הכיסוי כנגד הגולגולת בעזרת פינצטה עדינה כדי להבטיח מרחק מינימלי בין המוח לבין הכיסוי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
25G x 16 מ"מ מחטים היפודרמיות	מיקרולנס BD
ספוג ג'לטין נספג	פייזר	300600
כיסויים עגולים 6 מ"מ	VWR הבינלאומי		גלפועם
דבק ציאנואקרילט	פאטקס	631-0168	Pattex Ultra ג'ל
מלט דנטלי	ורטקס דנטל		ריפוי עצמי של קודקוד
מקדחה	דרמל		Dremel 3000 (מקדחה דנטלית עשויה להיות נוחה יותר) + 105 חותך חריטה
פינצטה מעוקלת עדינה	דומונט
שמן סיליקון	סיגמא אולדריץ'	AGT508
מסגרת סטריאוטקסית	סטולטינג	181838
מיקרוסקופ סטריאו כירורגי	אולימפוס		מעבדה סטנדרטית סטריאוטקסית, חולדה ועכבר
משחה אופתלמית	קלה וטרינריה		Duodrops veter kela 10 מטר
קסילוקאין (לידוקאין 1% + אפינפרין 1:100,000) הרדמה מקומית	אסטרהזניקה		קסילוקאין (לידוקאין 1% + אפינפרין 1:100,000)
היפנורם	VetaPharma בע מ		היפנורם (פנטניל ציטראט 0.315 מ"ג/מ"ל + פלואניסון 10 מ"ג/מ"ל)
מידזולאם	אקטביס		Midazolam Actavis 5 מ"ג/מ"ל