$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הדמיה תוך-חיונית
הערה: מרווח הזמן בין הזרקת תאי הגידול לבין פגישת ההדמיה התוך-חיונית הראשונה תלוי בסוג קו תאי הגידול בו נעשה שימוש. עבור הניסויים המוצגים בפרוטוקול זה, 1x 105 תאי GL261 הוזרקו וצולמו 10 ימים לאחר מכן.
- הכנת הדמיה
- הרגיעו את העכבר באמצעות הרדמה באינהלציה איזופלורנית באמצעות מסכת פנים (תערובת איזופלורן/O2 של 1.5%-2%).
- הזריקו לעכבר תת עורית 100 μL של חיץ מי מלח למניעת התייבשות.
הערה: עבור הדמיה לטווח ארוך, העכבר יכול להיות hydrated באמצעות משאבת עירוי תת עורית.
- מקם את העכבר עם הפנים כלפי מעלה בתיבת הדמיה. השתמש בלוח מתכת עם חור בקוטר 1 מ"מ ומגנטים קטנים המוטבעים סביב הצמצם כדי לספק קיבוע של CIW לקופסת ההדמיה. יש להכניס איזופלורן דרך מסכת פנים ולאוורר על ידי שקע בצד השני של הקופסה (תערובת איזופלורן/O2 0.8%-1.5%). לחלופין, השתמש בקלטת כדי לתקן את גוף העכבר.
הערה: דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית להדמיית כלי דם או צבעים אחרים עשוי להיות מוזרק תוך ורידי בשלב זה.
- לחלופין, השתמש במד דופק אוקסימטר ובבדיקת חימום כדי לפקח על חיוניות המוס.
הערה: בניסוי זה, לא היה צורך להשתמש במד דופק אוקסימטר ובבדיקת חימום מכיוון שהעכבר היה יציב לאורך כל תקופת זמן ההדמיה (2-3 שעות). עם זאת, עבור זמני הדמיה ארוכים יותר, ייתכן שיהיה צורך בניטור יסודי יותר.
- הגדר את יעד המים 25x (לדוגמה, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 מ"מ) למיקום z הנמוך ביותר והוסף טיפת מים גדולה.
הערה: השימוש במתקן טבילה במים מומלץ מאוד לניסויים ארוכי טווח מכיוון שהוא מאפשר למדענים להוסיף מים במהלך הניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש במטרה יבשה.
- העבירו את קופסת ההדמיה למיקרוסקופ המצויד בתא אקלים כהה הנשמר בטמפרטורה של 37°C. הביאו את המטרה לכיסוי CIW עד שטיפת המים תיגע בו.
- באמצעות מצב epifluorescence, להתבונן בגידול דרך העינית ולהביא את התאים למיקוד.
2. רכישת תמונה בהילוך מהיר
- בחר מספר עמדות מעניינות כדי לצלם ולהקליט את הקואורדינטות שלהם בתוכנה. ודא שהתנוחות שנבחרו הן עמדות מייצגות מאתרים שונים של הגידול (כל גידול יכול להיות שונה, אך כדי להבטיח עקביות, בחר את אותה כמות של מיקומים מרכזיים בליבת הגידול ובקצוות בכל העכברים).
הערה: ניתן לבצע סריקת אריחים של חלק מהגידול או של הגידול הנראה כולו; עם זאת, אם הגידול גדול, שיטה זו תגדיל את הזמן בין תמונות. בנוסף, אם תאי הגידול נעים מהר, זה יכול להיות מאתגר לעקוב אחר אותם תאים לאורך זמן.
- עבור למצב מולטיפוטון וכוונן את הלייזר לאורך הגל הנכון. שים לב שכדי למנוע נזק לאור, אורכי גל גבוהים יותר רצויים.
הערה: עבור דימות Dendra2, נעשה שימוש באורך גל של 960 ננומטר. עם המטרה ששימשה בניסויים אלה, זום של 1.3 היה מספיק כדי לקבל רזולוציה טובה של גרעיני הגידול ולסרוק אזור מייצג של הגידול.
- עבור למצב חי והגדר ערימת z לכל מיקום על מנת להשיג את הנפח המרבי של תאי הגידול מבלי לפגוע ברזולוציית תאי הגידול. הגדירו את גודל הצעד בין התמונות כ- 3 מיקרומטר.
- השתמש במצב הדו-כיווני כדי להגביר את מהירות הסריקה. רזולוציית התמונה צריכה להיות לפחות 512 x 512 פיקסלים.
- קבל תמונות של נפח הגידול בתנוחות שונות כל 20 דקות במשך 2 שעות. הוסף מים למטרה לפני כל רכישת תמונה.
הערה: ניתן לרכוש תמונות קיטועי זמן באופן אוטומטי על ידי הגדרת קיטועי הזמן הנכונים בתוכנה. עם זאת, העכבר יכול לזוז, והמיקום או מחסנית z יכולים להשתנות עם הזמן, ולגרום לאובדן נתונים. לכן, מומלץ לבצע את הילוך הזמן באופן ידני ולבדוק ולהתאים למשמרות xyz בין רכישות.
- בשלב זה, באופן אופציונלי, החלף את הסמן הפלואורסצנטי Dendra2.
הערה: בניגוד לדימות בהילוך מהיר (המאפשר לחקור תכונות של תאי גידול בודדים וכיצד הם משתנים לאורך זמן), הדבר יאפשר לחקור את אזור חדירת תאי הגידול במוח במשך מספר ימים.