1. בדיקת משיכה של מקרופאגים במבחנה
- הכנת מדיה מותנית
- חממו את מדיום תחזוקת תאי הגידול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- רססו את משטח מכסה המנוע של תרבית הרקמה ב-70% אתנול ונגבו 70% אתנול על פני השטח במגבות נייר. קחו את תמיסת ניתוק התאים מהמקרר. רססו את בקבוקי המדיום ואת תמיסת ניתוק התאים באתנול 70%, נגבו 70% אתנול על פני השטח עם מגבות נייר, והכניסו אותם למכסה המנוע של תרבית הרקמות.
- הוציאו את צלחות 6 הבארות מהאינקובטור. בזהירות pipepe את המדיה המותנית לתוך צינורות צנטריפוגות סטריליות 15 מ"ל. שים את הצינורות על קרח. פיפטה את המדיה ב"מדיה בלבד" היטב לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי נפרד 15 מ"ל.
הערה: לפני שלב זה, הקפד לבדוק מתחת למיקרוסקופ אם התאים מתחברים. אם לא, ניתן להשתמש בלוחות מצופים כדי לאפשר חיבור טוב יותר או לכלול את התאים הצפים בשלב הספירה.
- הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לכל באר של צלחת 6 בארות. בדוק אם תאי הגידול מתעגלים כל דקה. ברגע שתאי הגידול מתעגלים, טפחו בעדינות על צד הצלחת כדי לעזור לתאים להתנתק.
- פיפטה 2.5 מ"ל של תווך תחזוקת תאי הגידול לתוך הבאר, פיפטה למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב ולהעביר את התאים לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל. קח 10 μL של התאים ולערבב עם 10 μL של תמיסת Trypan Blue. פיפטה 10 μL של התערובת לתוך שקופית הספירה ולכמת את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
- התאם את נפח המדיה הממוזגת בהתאם למספר התא באמצעות מדיום תאי גזע ללא סרום (דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה). לדוגמה, אם לבאר A יש פי 3 תאים חיים מאשר לבאר עם מספר התאים הקטן ביותר, דללו את המדיה המותנית שלה ביחס של 1:3. שלב זה משמש לשליטה בהבדל הנגרם על ידי קצב התפשטות תאים.
הערה: הסיבה להשתמש בתווך תאי גזע ללא סרום עם דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה היא לשלוט בשינוי האפשרי בתקשורת עם חשיפה ממושכת של 37 מעלות צלזיוס.
- סנן את המדיה הממוזגת דרך מסננים של 0.45 מיקרומטר. שים את המדיה המותנית על קרח.
הערה: שלב זה מסיר תאים ופסולת תאים במדיה הממוזגת.
2. הכנת תאי MV-4-11
- חממו את מדיום IMDM (ללא FBS) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- רססו את משטח מכסה המנוע של תרבית הרקמה ב-70% אתנול ונגבו 70% אתנול על פני השטח במגבות נייר. רססו את הבקבוק הבינוני ב-70% אתנול, נגבו 70% אתנול על פני השטח במגבות נייר והכניסו אותם למכסה המנוע של תרבית הרקמות.
- קח את הבקבוק של תאי MV-4-11 לתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה. פיפטה 10 מ"ל של תאים לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל. קח 10 μL של תאים ולערבב עם 10 μL של תמיסת Trypan Blue. פיפטה 10 μL של התערובת לתוך שקופית הספירה ולכמת את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5min ב 4 ° C. לשאוף את supernatant.
- לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant.
- השהה מחדש את התאים בתווך IMDM (ללא FBS) לקבלת צפיפות תאים סופית של 1x106 תאים/mL.
הערה: ניתן להתאים את מספר התאים של המקרופאגים המשמשים כאן.
3. בדיקת Transwell
הערה: עבור שלב זה, השתמש בערכת בדיקת העברת תאים או רכוש את הריאגנטים והכנס בנפרד. לתאי MV-4-11, בחרו 'תוספות Transwell' בגודל נקבוביות של 5 מיקרומטר. כדי לזהות נדידת מקרופאגים, כמת ישירות את מספר המקרופאגים בתא התחתון או השתמש בשיטות קולורימטריות/פלואורימטריות. כאן, אנו מדגימים את הבדיקה באמצעות השיטה colorimetric.
- מביאים את הצלחת בת 24 הבארות, את האינסרט ואת הריאגנטים לטמפרטורת החדר.
- הוסף 250 μL של תאי MV-4-11 שהוכנו לעיל לכל תוספת.
- הוסף 400 μL של מותנה בינונית/בינונית בלבד (עם דגירה של לילה ב 37 ° C, דגימות אלה משמשות כבקרה שלילית) לחדרים התחתונים של צלחת 24 בארות. עבור כל קו גידול או ביקורת, השתמש בדגימות משולשות. הימנעו מבועות בין העלון למדיום המותנה. בועות יעכבו מקרופאגים מלנדוד לבארות התחתונות.
- לדגור על הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 4 שעות
הערה: ניתן לכוונן את זמן הדגירה. תאים הנודדים לתוך החדרים התחתונים ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.
- הקש בעדינות על האינסרט בקיר הפנימי של אותה באר והשלך את העלון. מכיוון שתאי MV-4-11 גדלים בתרחיף, אין צורך כאן בתמיסת ניתוק תאים או בטיפול בטריפסין.
- בעדינות פיפטה את התאים בבארות למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב. מעבירים 225 μL של תרחיף תאים לצלחת בעלת דופן שחורה בעלת 96 בארות המתאימה למדידת פלורסנט.
- לדלל את צבע CyQuant 1:75 עם חיץ ליזיס 4x. מערבלים לרגע ומסובבים את הפתרון. הוסף 75 μL של תמיסה לכל באר של צלחת 96 באר. יש לדגור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- קרא פלואורסצנטיות באמצעות מסנן 480/520 ננומטר עם קורא לוחות פלואורסצנטיים.
- נתח נתונים על ידי חיסור הריק ונורמליזציה לקו תאי הגידול בקרה.
