מיצוי שלפוחית חוץ-תאית: טכניקה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות רקמות שלמות באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית

תקציר

מקור: Hurwitz, S. N. et al. מיצוי שלפוחיות חוץ-תאיות מרקמה שלמה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מרקמות טריות או קפואות. ניתן להשתמש בשלפוחיות החוץ תאיות המבודדות לניתוח נוסף כדי לחשוף את תפקידיהן המשמעותיים בפתוגנזה של מחלות.

פרוטוקול

1. דיסוציאציה של רקמות וצנטריפוגה דיפרנציאלית

1. הכן 10 מ"ל של חיץ דיסוציאציה (10 מ"ג פפאין; 5.5 מ"מ L-ציסטאין; 67 מיקרומטר 2-מרקפטואתנול; 1.1 מ"מ EDTA) במדיום Hibernate-E עבור כ 0.4-1.0 גרם של רקמה.
   הערה: יש לדלל את כל הפתרונות המשמשים להעשרה וטיהור של כלי רכב חשמליים במים מסוננים טהורים במיוחד.
2. יש להוסיף רקמה טרייה או קפואה שלמה לחיץ דיסוציאציה בצינור חרוטי של 50 מ"ל ולדגור באמבט מים חמים בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. ניתן לחתוך את הרקמה לשברים קטנים יותר לפני הדגירה במידת הצורך.
3. לאחר הדגירה, יש להוסיף מעכבי פרוטאז ופוספטאז לריכוז סופי של 1x למאגר הדיסוציאציה המכיל את הרקמה.
4. יוצקים את התמיסה המכילה את הרקמה לתוך הומוגנייזר Dounce רפוי, ומנתקים בעדינות את הרקמה באמצעות כ-30 משיכות איטיות לדגימה. ניתן להתאים את מספר השבץ בהתאם לעקביות הרקמות.
5. העבר רקמה מנותקת בחיץ לצינור חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לגלול את התאים ואת שברי רקמה סיביים או מלוכדים שנותרו.
6. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי נקי של 50 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C כדי לזרוק ולהשליך פסולת תאית גדולה.
7. העבירו את הסופרנאטנט שוב לצינור חרוטי נקי של 50 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x גרם למשך 40 דקות ב-4°C כדי להוציא שלפוחיות גדולות יותר או גופים אפופטוטיים קטנים.
   הערה: ניתן לשמור גלולה זו למחקר נוסף של שלפוחיות גדולות יותר במידת הצורך.
8. דקרו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה נקי של 12 מ"ל.
   הערה: דגימות רקמה פיברוטית צפופה עשויות שלא להיות מסוננות בקלות. דגימות אלה יכולות להיות מסוננות דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן לעבור דרך מחטים קטנות יותר סדרתית (18 גרם, 20 גרם, 22 גרם) לפני סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
9. אולטרה-צנטריפוגה את הדגימה ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C כדי pellet כלי רכב חשמליים קטנים.
10. דקרו את הסופרנאטנט והשאירו את צינורות האולטרה-צנטריפוגה הפוכים למשך 5-10 דקות, תוך הקשה תכופה כדי להסיר שאריות נוזל בצידי הצינורות. נוזל שאריות יכול גם להיות שואף באמצעות פיפטה ואקום.
11. להשהות מחדש את גלולת EV ב-1.5 מ"ל של חיץ סוכרוז 0.25 מ' (10 מ"מ טריס, pH 7.4). חשוב להבטיח השעיה מלאה של הגלולה בשלב זה. כדי לעשות זאת, כסו את הצינורות בפרפילם לפני ערבול כלי רכב חשמליים לתמיסה. נענעו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר לפני ערבוב מערבולת סופי.
12. צנטריפוגו לזמן קצר את הצינורות במהירות שאינה עולה על 1,000 x גרם כדי לשחזר את המתלה הנוזלי בתחתית הצינור.
13. המשיכו לשלבי הטיהור ההדרגתיים שלהלן, או במידת הצורך, אחסנו את מתלי הרכב החשמלי בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסנן 0.45 מיקרומטר	VWR	28145-505
12 מ"ל צינורות אולטרה-צנטריפוגות	בקמן קולטר	331372
5.5 מ"ל צינורות אולטרה-צנטריפוגות	בקמן קולטר	344057
מעכב פוספטאז HALT (תמיסה פי 100)	תרמופישר סיינטיפיק	78420
מעכב פרוטאז HALT (תמיסת 100x)	תרמופישר סיינטיפיק	78438
מצב שינה E בינוני	תרמופישר סיינטיפיק	A1247601
רוטור דלי מתנדנד MLS-50	בקמן קולטר	367280
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	בקמן קולטר	393315