טיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות: טכניקה לטיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות

תקציר

מקור: Urwitz, S. N. et al. חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מרקמה שלמה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את שיטת הטיהור מבוססת צפיפות גרדיאנט אולטרה-צנטריפוגה לבידוד תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות המתאימות למחקרי אפיון.

פרוטוקול

1. טיהור הדרגתי צפיפות

1. הוסף 1.5 מ"ל של 60% יודיקסנול (תמיסת מלאי במים) למאגר 1.5 מ"ל סוכרוז/טריס המכיל כלי רכב חשמליים כדי ליצור תמיסה סופית המכילה 30% יודיקסנול. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב פתרון ביסודיות.
   הערה: היזהר כדי למנוע לאבד פתרון בקצה פיפטה, כמו ריכוז יודיקסנול גבוה הוא צמיג למדי.
2. העבר את תמיסת חיץ היודיקסנול 30% המכילה כלי רכב חשמליים לתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה בנפח 5.5 מ"ל.
3. הכינו לפחות 1.5 מ"ל של 20% ו-10% תמיסות יודיקסנול לדגימה במים אולטרה-טהורים מתמיסת מלאי 60% יודיקסנול.
4. יש למדוד 1.3 מ"ל של 20% יודיקסנול ולהניח בזהירות על גבי שכבת השיפוע התחתונה באמצעות מזרק ומחט 18 גרם. כדי למנוע ערבוב השכבות בממשק הצפיפות, שמור את שיפוע המחט במגע עם החלק הפנימי של צינור האולטרה-צנטריפוגה ממש מעל המניסקוס והוסף את התמיסה טיפתית.
5. שכבה 1.2 מ"ל של תמיסת 10% יודיקסנול על גבי שכבת 20% יודיקסנול באותה טכניקה כמו לעיל.
6. אזנו בזהירות והעמיסו את צינורות האולטרה-צנטריפוגה לדלי רוטור וצנטריפוגה ברוטור דלי נדנדה במהירות של 268,000 x גרם למשך 50 דקות ב-4°C. הגדר את מהירויות ההאצה וההאטה של הצנטריפוגה לקצבי המינימום המותרים כדי למנוע הפרעה לשכבות הצפיפות.
7. תייגו עשר שפופרות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל עבור כל דגימה כך שיתאימו לשברים 1 עד 10 של שיפועי הצפיפות. שבר 1 מוגדר כשבר העליון ביותר שיוסר ראשון, ואילו שבר 10 הוא השבר התחתון שהוסר לאחרונה.
8. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה ההדרגתית, הסר בעדינות את הצינורות מדלי הרוטור והנח במחזיק יציב. רצועה גלויה של שלפוחיות תיראה לעתים קרובות בשבריר העניין. פיפטה עשרה שברים טוריים של 490 μL מראש השיפוע לתוך צינורות המתאימים. בתחתית הצינור תישאר כמות קטנה של נוזל שככל הנראה מכיל חלבונים מזהמים. מדגם זה ניתן להשליך או לשמור כשבר 11, אם תרצה.
9. מדוד את מדדי השבירה של שברים באמצעות רפרקטומטר. ניתן לבצע זאת גם באמצעות הפעלת שיפוע בקרה במקביל אם יש צורך בשימור דגימה. פיפטה 20-30 μL מכל שבר המכיל יודיקסנול על פני הרפרקטומטר ולהעריך את הצפיפות על ידי השוואת מדדי השבירה לצפיפויות יודיקסנול ידועות.
   הערה: ניתן לאחסן שברים למשך הלילה בתמיסה המכילה יודיקסנול במידת הצורך לפני שממשיכים לשלב שטיפת האולטרה-צנטריפוגה הבא.
10. העבר כל שבר לצינור אולטרה-צנטריפוגה נקי של 12 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מי מלח חוצצי פוספט 1x (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4) לצינור וערבב על ידי פיפטינג איטי למעלה ולמטה.
    הערה: PBS שנוסף לדגימות צריך להיות נטול חלקיקים, מובטח על ידי סינון PBS סטרילי דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסון בטמפרטורת החדר כדי למנוע משקעים מלוחים.
11. הוסף 6 מ"ל נוספים של 1x PBS לחלק העליון ושוב ערבב בזהירות.
12. אולטרה-צנטריפוגה את הצינורות ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C כדי repellet שלפוחיות קטנות. דקרו את הסופרנאטנט והקישו את הצינורות לפני ליזה של שלפוחיות לניתוח חלבונים או השעיה מחדש של EVs לאנליזה מורפולוגית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסנן 0.45 מיקרומטר	VWR	28145-505
12 מ"ל צינורות אולטרה-צנטריפוגות	בקמן קולטר	331372
5.5 מ"ל צינורות אולטרה-צנטריפוגות	בקמן קולטר	344057
רוטור FA-45-6-30	אפנדורף	5820715006
רוטור דלי מתנדנד MLS-50	בקמן קולטר	367280
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	בקמן קולטר	393315
Optima XE-100 אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	A94516
אופטיפרפ	סיגמא	D1556	60% יודיקסנול בתמיסת מים סטריליים
Refracto 30PX (רפרקטומטר)	מטלר טולדו	51324650
רוטור S-4-104	אפנדורף	5820759003
SW 41 Ti דלי מתנדנד רוטור	בקמן קולטר	333790
צנטריפוגת שולחן 5804R	אפנדורף	22623508