יצירת תאי גזע עצביים מושרים (iNSCs) מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMNCs): הליך מבוסס וירוס סנדאי לתכנות מחדש של PBMNCs לתאי גזע מושרים

תקציר

מקור: Zheng, W. et al. יצירת תאי גזע עצביים מושרים מתאים חד-גרעיניים היקפיים והתמיינות לקראת מבשרי נוירונים דופמינרגיים למחקרי השתלות.J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים תכנות מחדש של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMNCs) לתאי גזע עצביים מושרים (iNSCs) באמצעות וירוס סנדאי. וירוס סנדאי הוא וירוס שאינו משלב ומציע כלי יעיל ובטוח לתכנות מחדש של תאים.

פרוטוקול

1. תכנות מחדש של PBMNCs ל- iNSCs על ידי זיהום SeV

1. הכנת פתרון ומדיום תרבות
   1. הכינו תמיסת מלאי פולי-D-ליזין (PDL) על ידי המסת 100 מ"ג PDL עם 100 מ"ל של H₂O לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן ב -20 °C ב 1 מ"ל aliquots.
   2. הכינו תמיסת מלאי אינסולין על ידי המסת 100 מ"ג אינסולין ב-20 מ"ל של 0.01 N HCl לריכוז של 5 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן ב -20 °C ב 1 מ"ל aliquots.
   3. כדי להכין 200 מ"ל של מדיום בסיסי iNSC, לשלב 96 מ"ל של DMEM-F12 ו 96 מ"ל של מדיום בסיסי (טבלה של חומרים) עם 2 מ"ל של 100x תמיסת מלאי גלוטמין, 2 מ"ל של חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 2 מ"ל של תוסף N2 ו 2 מ"ל של תוספת B27. יש להוסיף 10 ננוגרם/מ"ל גורם מעכב לוקמיה אנושי רקומביננטי, 3 מיקרומטר CHIR99021 ו-2 מיקרומטר SB431542 לפני השימוש. סנן את המדיום ואחסן אותו ב- 4 ° C.
      הערה: השתמש במדיום תוך שבועיים. יש להוסיף גורם מעכב רקומביננטי של לוקמיה אנושית, CHIR99021 SB431542 מיד לפני השימוש.
2. תכנות מחדש של PBMNCs ל- iNSCs על ידי זיהום SeV
   1. אולטרה סגול - לעקר ספסל נקי לפני השימוש. יש לעקר את כל המשטחים והציוד עם 75% אלכוהול. לעקר את כל הטיפים באמצעות autoclave.
   2. ביום 0, לאסוף את התאים בתווך MNC ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים עם 1 מ"ל של מדיום MNC שחומם מראש.
   3. ספור את התאים קיימא עם כחול טריפאן. להשעות מחדש את התאים עם מחומם מראש (37 ° C) MNC בינוני לריכוז של 2 x 10⁵ תאים לכל באר ב 24 צלחות באר.
   4. לאחר הסרת צינורות SeV מאחסון -80 °C, הפשירו את הצינורות המכילים SeV באמבט מים של 37 °C למשך 5-10 שניות, ולאחר מכן אפשרו להם להפשיר ב- RT. לאחר ההפשרה, הניחו אותם מיד על קרח.
   5. הוסף את הקידוד האנושי SeV Klf4, Oct3/4, SOX2 ו- c-MyC לבארות, בריבוי זיהום (MOI) של 10. תאי צנטריפוגה עם צלחות ב 1,000 x גרם במשך 30 דקות כדי להקל על החיבור של תאים. השאירו את התאים ואת supernatant בצלחות. מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂.
      זהירות: כל ההליכים המערבים SeV חייבים להתבצע בארון בטיחות, וכל הטיפים והצינורות צריכים להיות מטופלים עם אתנול או אקונומיקה לפני השלכה.
   6. ביום הראשון, להעביר את התווך ואת התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. לשטוף את הבאר עם 1 מ"ל של MNC בינוני. צנטריפוגה את מתלה התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים עם 500 μL של מדיום MNC טרי שחומם מראש בצלחות 24 בארות.
      הערה: השתמש בצלחת 24 בארות עם חיבור נמוך כדי למנוע חיבור של תאים כלשהם לפני ציפוי PDL/למינין.
   7. ביום השני, יש לדלל 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל PDL עם 19 מ"ל של D-PBS לריכוז של 50 מיקרוגרם/מ"ל. צפו צלחות 6 בארות עם PDL של 50 מיקרוגרם/מ"ל למשך שעתיים לפחות ב-RT.
   8. לדלל 200 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל למינין עם 20 מ"ל של D-PBS לריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל. שואפים PDL בצלחות 6 בארות, ומייבשים על הספסל הנקי האנכי.
   9. מצפים צלחות 6 בארות בלמינין 5 מק"ג/מ"ל ודגרים במשך 4-6 שעות ב-37°C. יש לשטוף עם D-PBS לפני השימוש.
   10. ביום השלישי, צלחת את התאים המומרים שהתקבלו בשלב 1.2.6 בתווך iNSC על לוחות PDL/למינין מצופים 6 בארות.
       הערה: הזיזו את הצלחות בעדינות במידת הצורך לאחר שהתאים מונחים על לוחות מצופים PDL/למינין, בניסיון לא להפריע לחיבור התאים.
   11. ביום 5, להוסיף 1 מ"ל של מחומם מראש (37 ° C) iNSC בינוני בכל באר בצלחות 6 באר בעדינות.
       הערה: הצפי הוא שהתאים יעברו מוות דרסטי (>60%).
   12. ביום השביעי, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום iNSC שחומם מראש (37°C) בכל באר בצלחות 6 בארות בעדינות.
   13. מיום 9 עד יום 28, החלף את המדיום המשומש בתווך iNSC טרי שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) מדי יום. עקוב אחר הופעתן של מושבות iNSC. בחר והעבר שיבוטים של iNSC להרחבה תוך כ 2-3 שבועות. אספו מושבות עם מורפולוגיה מתאימה באמצעות פיפטות זכוכית שרופות, למעט תאים שעלולים להיות מזהמים, ושאפו את המושבות עם קצוות של 200 μL.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף B27	Invitrogen	17504044
CHIR99021	ניתוח גנים	04-0004
DMEM-F12	גיבקו	11330
DMEM-F12	גיבקו	11320
למינין	רוש	11243217001
תוספת N2	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	חומצת אמינו לא חיונית
נוירובזל	גיבקו	10888	מדיום בסיסי
PDL	סיגמא-אולדריץ'	P7280	פולי-די-ליזין
SB431542	ניתוח גנים	04-0010-10 מ"ג	לאחסן מאור ב -20?
וירוס סנדאי	לייף טכנולוגיות	MAN0009378
אינסולין	רוש	12585014
צלחת 24 בארות	קורנינג	3337
צינור חרוטי 15 מ"ל	קורנינג	430052
צלחת 6 בארות	קורנינג	3516
EPO	פפרוטק	100-64-50 מ"ג	אריתרופויאטין אנושי
גורם מעכב לוקמיה אנושית	מילפור	LIF1010
SCF רקומביננטי אנושי	פפרוטק	300-07-100UG
IGF-1	פפרוטק	100-11-100 מ"ג	גורם גדילה דמוי אינסולין אנושי
IL-3	פפרוטק	200-03-10UG	אינטרלוקין אנושי 3
דקסמתזון	סיגמא-אולדריץ'	D2915-100 מ"ג
IMDM	גיבקו	215056-023	המדיום של איסקוב שונה של דולבקו
אינסולין	רוש	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניום-X
גלוטמקס	Invitrogen	21051024	100 × תמיסת מלאי גלוטמין
Ham's-F12	גיבקו	11765-054
1-תיוגליצרול	סיגמא-אולדריץ'	M6145	רעיל לשאיפה ולמגע עם העור
חומצה אסקורבית	סיגמא-אולדריץ'	A92902	רעיל במגע עם העור
החלפת סרום נוקאאוט	גיבקו	10828028	מדיום בסיסי ללא סרום
תרכיז שומנים מוגדר כימית	Invitrogen	11905031
טרנספרין	מערכות מו"פ	2914-HT-100 גרם
כחול טריפאן	גיבקו	T10282