בידוד DNA ללא תאים במחזור הדם (cfDNA): הליך קרום מבוסס סיליקה לחילוץ cfDNA מפלזמת הדם של חולי סרטן

תקציר

מקור: Palande, V. et al. איתור DNA ללא תאים בדגימות פלסמה בדם של חולי סרטן. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר הליך קרום מבוסס סיליקה לבידוד DNA ללא תאים במחזור הדם או cfDNA מדגימת פלזמה אנושית. cfDNA הוא סמן ביולוגי מבטיח לאבחון והערכה של סרטן.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. טיהור cfDNA במחזור מ 1 מ"ל של פלזמה

הערה: שלב זה מתבצע באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים). כל המאגרים מסופקים עם הערכה.

1. הכנת חוצצים וריאגנטים
   זהירות: אין להוסיף תמיסות חומציות או אקונומיקה ישירות לפסולת הכנת הדגימה. מלחי גואנידין הנמצאים במאגר ליזיס, במאגר קשירה וב-Wash Buffer-1 בשילוב עם אקונומיקה או חומצות יכולים לייצר תרכובות תגובתיות מאוד.
   1. מאגר קשירה: ערבב 300 מ"ל של תרכיז חיץ קשירה עם 200 מ"ל של 100% איזופרופנול כדי ליצור 500 מ"ל של חיץ קשירה עובד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: חיץ קשירה מאפשר קשירה אופטימלית של חומצות הגרעין במחזור הדם לקרום הסיליקה. 500 מ"ל של חיץ מחייב מספיק לעיבוד 276, 138, 92, 69 או 55 דגימות של 1, 2, 3, 4 או 5 מ"ל של פלזמה בהתאמה והוא יציב במשך שנה אחת בטמפרטורת החדר.
   2. Wash Buffer-1: ערבבו 19 מ"ל של תרכיז Wash Buffer-1 עם 25 מ"ל של 96-100% אתנול כדי ליצור 44 מ"ל של Wash Buffer-1 עובד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: Wash Buffer-1 מסלק את המזהמים הקשורים לקרום הסיליקה. 44 מ"ל של עבודה Wash Buffer-1 מספיק לעיבוד 73 דגימות של 1/2/3/4/5 מ"ל של פלזמה והוא יציב במשך שנה אחת בטמפרטורת החדר.
   3. Wash Buffer-2: יש לערבב היטב 13 מ"ל תרכיז Wash Buffer-2 עם 30 מ"ל של 96-100% אתנול כדי ליצור 43 מ"ל של Wash Buffer-2 עובד. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: Wash Buffer-2 מסלק את המזהמים הקשורים לקרום הסיליקה. 43 מ"ל של עבודה Wash Buffer-2 מספיק לעיבוד ~ 56 דגימות של 1/2/3/4/5 מ"ל של פלזמה והוא יציב במשך שנה אחת בטמפרטורת החדר.
   4. לצינור המכיל 310 מיקרוגרם RNA נשא ליופילי, יש להוסיף 1,550 μL של חיץ אלוטיון, כדי להכין תמיסת RNA נשאית של 0.2 מיקרוגרם/μL. לאחר המסה יסודית של הרנ"א המוביל, מחלקים את התמיסה לאליציטוטים מתאימים, ומאחסנים ב -30 ° C עד -15 ° C. אין להקפיא-להפשיר aliquots אלה יותר מ 3 פעמים. למאגר הליזיס, כפי שמוצג בטבלה 1, הוסף את הרנ"א המוביל המומס במאגר Elution.
      הערה: מכיוון שרנ"א נשא אינו מתמוסס ישירות במאגר ליזיס, יש להמיס אותו תחילה במאגר אלוציה ולאחר מכן בחיץ ליזיס. ראשית, קשירת קרום סיליקה וחומצות גרעין משופרת כאשר יש מעט מאוד מולקולות מטרה הקיימות בדגימה. שנית, הסיכון לפירוק RNA מופחת בגלל נוכחות של כמויות גדולות של RNA נשא.
2. לפני תחילת הבידוד, הביאו את העמודות והדגימות לטמפרטורת החדר והתאימו את נפחי הדגימה ל-1 מ"ל עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS), במידת הצורך. מחממים מראש 2 אמבטיות מים או בלוקים לחימום המכילים צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצינורות איסוף 2 מ"ל ל 60 ° C ו 56 ° C, בהתאמה.
3. לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, הוסף 100 מיקרוליטר של פרוטאינאז K, פלזמה של 1 מ"ל ו-0.8 מ"ל של חיץ ליזיס המכיל 1.0 מיקרוגרם של RNA נשא (שהוכן בשלב 1.1.4). סגור את צינור הצנטריפוגה עם מכסה וערבב את התוכן על ידי מערבולת פולס במשך 30 שניות, תוך הבטחת מערבולת גלויה בצינור. ערבוב יסודי של התכולה חשוב לליזה יעילה.
   הערה: מיד לאחר המערבולת, המשך לשלב 1.4, ללא דיחוי.
4. יש לדגור על התמיסה בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות.
5. הסר את המכסה, הוסף 1.8 מ"ל של חיץ הקשירה לצינור, וערבב היטב עם מערבולת הדופק במשך 15-30 שניות לאחר הנחת המכסה.
6. דוגרים על התערובת המתקבלת במשך 5 דקות על קרח ומכניסים את עמוד קרום הסיליקה למנגנון הוואקום המחובר למשאבת הוואקום. לאחר מכן, הכנס בחוזקה מאריך צינור של 20 מ"ל לעמודה הפתוחה כדי למנוע דליפת דגימה.
7. בזהירות יוצקים את התערובת המודגרת לתוך מאריך הצינור של העמוד ומפעילים את משאבת הוואקום. אחרי הכל, תערובת הליזט עוברת לחלוטין דרך העמודות, כבה את משאבת הוואקום, שחרר את הלחץ ל 0 mbar, והסר והשליך את מאריך הצינור.
   הערה: הימנעות זיהום צולב, מאריך הצינור צריך להיות מושלך בזהירות, כדי למנוע התפשטות שלה על עמודים סמוכים.
8. הסר את העמוד ממנגנון הוואקום, הכנס לצינור האיסוף, וצנטריפוגה במהירות של 11,000 x גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, כדי להסיר שאריות ליזט. מחק את הזרימה.
9. הוסף 600 μL של Wash Buffer-1 לעמודה, צנטריפוגה ב 11,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, להשליך את הזרימה.
10. הוסף 750 μL של Wash Buffer-2 לעמודה, צנטריפוגה ב 11,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והשליך את הזרימה.
11. הוסף 750 μL אתנול (96-100%) לעמודה, צנטריפוגה ב 11,000 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולזרוק את הזרימה.
12. צנטריפוגו את העמוד במהירות של 20,000 x גרם למשך 3 דקות, על ידי הכנסתו לצינור איסוף נקי של 2 מ"ל.
13. יבש את מכלול עמוד הממברנה לחלוטין על ידי הכנסתו לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל עם מכסה פתוח ודגירה ב 56 ° C למשך 10 דקות.
14. מניחים את העמוד בצינור אלוציה נקי של 1.5 מ"ל. למרכז קרום העמוד, יש למרוח 20-150 מיקרוליטר של חיץ אלוציה ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות כשהמכסה סגור.
    הערה: ודא כי מאגר Elution מאוזן לטמפרטורת החדר. במקרה של שימוש בחיץ אלוציה קטן מ-50 מיקרוליטר, יש לוודא שהוא מופץ בזהירות למרכז הממברנה. זה עוזר עם העלמת מוחלטת של הדנ"א הכבול. עם זאת, נפח ה- elution אינו קבוע וניתן לשנות אותו בהתאם ליישומים במורד הזרם. הפולט המשוחזר יכול להיות עד 5 μL ובוודאי פחות מנפח האלוציה שהוחל על העמודה.
15. צנטריפוגות שהתאוששו פולטות במיקרו-צנטריפוגה ב -20,000 x גרם למשך דקה אחת כדי ללוט את חומצות הגרעין, ולאחסן ב -20 ° C.

מספר מדגם	חיץ ליזיס (מ"ל)	RNA נשא במאגר Elution (μL)
1	0.9	5.6
2	1.8	11.3
3	2.6	16.9
4	3.5	22.5
5	4.4	28.1
6	5.3	33.8
7	6.2	39.4
8	7	45
9	7.9	50.6
10	8.8	56.3
11	9.7	61.9
12	10.6	67.5
13	11.4	73.1
14	12.3	78.8
15	13.2	84.4
16	14.1	90
17	15	95.6
18	15.8	101.3
19	16.7	106.9
20	17.6	112.5
21	18.5	118.1
22	19.4	123.8
23	20.2	129.4
24	21.1	135

טבלה 1. נפחים של חיץ ליזיס ורנ"א נשא (מומס במאגר אלוטיון) הדרושים לעיבוד דגימות פלזמה של 1 מ"ל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת DNA זריזה וגמישה בעלת רגישות גבוהה	Agilent טכנולוגיות, Inc.	5067-4626	בדיקות ה- DNA בעלות הרגישות הגבוהה משמשות לעתים קרובות לבקרת איכות דגימה עבור ספריות ריצוף של הדור הבא.
cf-DNA/cf-RNA צינורות משמרים	נורגן ביוטק קורפ	63950	צינורות השימור cf-DNA/cf-RNA של נורגן סגורים, צינורות פלסטיק מפונים לצורך איסוף ושימור cfDNA, DNA גידולי במחזור, cf-RNA ותאי גידול במחזור הדם בדגימות דם שלמות אנושיות במהלך האחסון והמשלוח
ערכת חומצת גרעין במחזור QIAamp	קיאגן	55114	ערכת חומצות הגרעין QIAamp במחזור הדם מאפשרת טיהור יעיל של חומצות גרעין אלה במחזור הדם מפלזמה או סרום אנושיים ומנוזלי גוף אחרים נטולי תאים.
סעפת ואקום QIAvac 24 Plus	קיאגן	19413	סעפת הוואקום QIAvac 24 Plus מיועדת לעיבוד ואקום של עמודי QIAGEN במקביל.
מערכת חיבור QIAvac	קיאגן	19419	בשילוב עם מערכת החיבור QIAvac, סעפת הוואקום QIAvac 24 Plus יכולה לשמש כמערכת זרימה. זרימת הדגימה, המכילה חומר זיהומי אפשרי, נאספת בבקבוק פסולת נפרד.
מערכת חיבור QIAvac	קיאגן	19419	בשילוב עם מערכת החיבור QIAvac, סעפת הוואקום QIAvac 24 Plus יכולה לשמש כמערכת זרימה. זרימת הדגימה, המכילה חומר זיהומי אפשרי, נאספת בבקבוק פסולת נפרד.
שונות
צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל
קרח כתוש
אתנול (96-100%)
בלוק חימום או דומה ב 56 ° C (מסוגל להחזיק 2 מ"ל צינורות איסוף)
איזופרופנול (100%)
מיקרוצנטריפוגה
מלח חוצץ פוספט (PBS)
פיפטות (מתכווננות)
טיפים פיפטה סטרילית (טיפים פיפטה עם מחסומי תרסיס מומלצים כדי לסייע במניעת זיהום צולב)
אמבט מים או בלוק חימום המסוגלים להחזיק צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ב 60 ° C