ניתוח התפלגות גודל מקטע אוטומטי מבוסס אלקטרופורזה נימית של CFDNA: שיטה מבוססת שבב DNA לחקר התפלגות גודל של מקטעי DNA שבודדו מנוזלים ביולוגיים

תקציר

מקור: Palande, V. et al. איתור DNA ללא תאים בדגימות פלסמה בדם של חולי סרטן. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מנתחים את התפלגות הגודל של מקטעי DNA או cfDNA ללא תאים באמצעות אלקטרופורזה נימית אוטומטית. טכניקה זו מסייעת לקבל תובנות לגבי הפרופיל של מקטעי DNA המשתחררים על ידי תאים סרטניים במהלך אפופטוזיס.

פרוטוקול

1. התפלגות גודל מקטע DNA של cfDNA על ידי מנתח מקטעים

1. השלב לפני תחילת ההליך: אזנו את תרכיז צבע הדנ"א ואת מטריצת ג'ל הדנ"א לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2. הכנת תערובת צבע ג'ל
   הערה: טפל בתמיסות בזהירות מכיוון ש- DMSO ידוע כמקל על כניסת מולקולות אורגניות לרקמות.
   1. הפשיר ביסודיות את DMSO על ידי ערבול בקבוקון תרכיז צבע DNA במשך 10 שניות. פיפטה החוצה 15 μL של תרכיז זה לתוך בקבוקון מטריצת ג'ל DNA ולאחסן ב 4 ° C בחושך.
   2. שוב, מערבבים את הבקבוקון הסגור במשך 10 שניות עד ערבוב של ג'ל וצבע הוא דמיין.
   3. יוצקים את התערובת על מסנן מסתובב לשקע העליון.
   4. מיקרו-צנטריפוגה של מסנן הסחיטה ב-2,240 x גרם ±-20% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. תייגו את צבע הג'ל המוכן בצינור והשליכו את המסנן, בהתאם לנוהלי מעבדה טובים. תייג את הצינור ורשום את תאריך ההכנה.
      הערה: יש להשליך את התסנין בהתאם לנוהלי מעבדה טובים. ניתן להשתמש בתערובת צבע הג'ל עבור 5 שבבי DNA בעלי רגישות גבוהה (HS). אם לא נעשה שימוש במשך יותר משעה אחת, יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. אחסון בחושך אפשרי עד 6 שבועות.
3. כדי לטעון את תערובת צבע הג'ל, ודא את המיקום של צלחת הבסיס של תחנת פרימינג השבבים ולהתאים את הקליפ במיקום הנמוך ביותר.
   1. אזנו את תערובת צבעי הג'ל לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, תוך ניטור החשיפה לאור.
   2. קח שבב DNA HS חדש משקית אטומה והנח אותו על תחנת ההכנה של השבב, ואז הסר 9.0 μL מתערובת צבע הג'ל וחלק אותו בתחתית באר השבב, המסומנת כ- 'G'.
      הערה: ציירו את תערובת צבעי הג'ל, והימנעו מחלקיקים שעלולים להצטבר בתחתית הבקבוקון. בעת חלוקת תערובת צבע הג'ל לתוך שבב DNA HS היטב, להכניס את קצה פיפטה לחלוטין כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר גדולות. יתר על כן, נגיעה פיפטה בשולי הבאר יניב תוצאות גרועות.
   3. מקם את הבוכנה ב 1 מ"ל ולסגור את תחנת שבב priming. ודא שהנעילה של התפס לוחצת והגדר את הטיימר ל -60 שניות, ואז לחץ על הבוכנה למטה עד שהיא מוחזקת על ידי הקליפ, ובדיוק לאחר 60 שניות, שחרר את הבוכנה עם מנגנון שחרור הקליפ.
   4. כאשר הבוכנה נסוגה לפחות לסימן 0.3 מ"ל, המתן 5 שניות, ואז משוך לאט חזרה למצב 1 מ"ל, ואז פתח את תחנת הבכורה של השבב ושוב הסר 9.0 μL של תערובת צבע הג'ל וחלק בתחתית שבב ה- DNA HS היטב, המסומן כ- 'G'.
4. כדי לטעון את סמן הדנ"א, יש להוציא 5 μL של סמן הדנ"א לתוך הבאר, המסומן בסמל הסולם. חזור על ההליך עבור כל 11 בארות הדגימה.
5. כדי לטעון את הסולם והדגימות, יש לחלק 1 μL של סולם הדנ"א בבאר, המסומן בסמל הסולם, ולאחר מכן להוסיף 1 μL של דגימה (בארות משומשות) או 1 μL של סמן (בארות שאינן בשימוש) בכל 11 בארות הדגימה.
6. מערבול את שבב ה- DNA HS למשך 60 שניות ב- 2,400 סל"ד על ידי מיקום השבב אופקית במתאם. ודא שהבליטה המקבעת את שבב ה- DNA HS אינה פגומה במהלך מערבולת.
7. כדי להכניס את שבב הדנ"א HS למכשיר מנתח הפרגמנטים, פתח את המכסה וודא שמחסנית האלקטרודה מוכנסת כראוי, ובורר השבבים ממוקם ל- 'dsHigh Sensitivity DNA' במכשיר מנתח השברים.
8. הרכיבו בזהירות את שבב ה- DNA HS לתוך כלי הקיבול, המתאים לכיוון אחד בלבד, ולאחר מכן סגרו את המכסה על ידי וידוא שמחסנית האלקטרודה מתאימה בדיוק לבארות של שבב ה- DNA HS.
9. התצוגה במסך תוכנת מנתח השברים מציינת את שבב ה- DNA HS שהוכנס ואת המכסה הסגור דרך סמל השבב בפינה השמאלית העליונה של המסך.
10. כדי להתחיל את ריצת שבב ה- DNA HS, בחר את בדיקת הרגישות הגבוהה dsDNA מתפריט 'Assay' במסך המכשיר, ולאחר מכן מלא כראוי את טבלת שמות הדגימות על ידי הזנת מידע כגון שמות דגימות והערות והתחל את הפעלת השבב על ידי לחיצה על כפתור 'התחל' בפינה השמאלית העליונה של המסך.
11. ניקוי אלקטרודות לאחר ריצת שבב HS DNA: הסר מיד את שבב ה- DNA HS המשומש מיד עם השלמת הבדיקה והשלך אותו בהתאם לנוהלי מעבדה טובים. בצע את ההליך הבא כדי לוודא שהאלקטרודות נקיות, ללא שאריות מהבדיקה הקודמת.
    1. מלאו באיטיות 350 מיקרוליטר של מים באיכות אנליזה דה-יונית באחת הבארות לניקוי אלקטרודות והניחו את מנקה האלקטרודות במכשיר מנתח השברים על ידי פתיחת המכסה ולאחר מכן סגרו את המכסה והמתינו כ-10 שניות.
    2. הסר את מנקה האלקטרודות על ידי פתיחת המכסה והמתן 10 שניות נוספות עד שהמים על האלקטרודות יתאדו לפני סגירת המכסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשיר ביואנלייזר 2100	Agilent טכנולוגיות, Inc.	G2939BA	מערכת 2100 Bioanalyzer היא כלי אלקטרופורזה אוטומטי מבוסס לבקרת איכות הדגימה של ביומולקולות.
קליפ מתכוונן לתחנת פרימינג	Agilent טכנולוגיות, Inc.	5042-1398	משמש בשילוב עם מזרק כדי להפעיל לחץ מוגדר עבור פרימת שבב.
cf-DNA/cf-RNA צינורות משמרים	נורגן ביוטק קורפ	63950	צינורות השימור cf-DNA/cf-RNA של נורגן סגורים, צינורות פלסטיק מפונים לצורך איסוף ושימור cf-DNA, DNA גידולי במחזור, cf-RNA ותאי גידול במחזור הדם בדגימות דם שלמות אנושיות במהלך האחסון והמשלוח
תחנת צ'יפ פרימינג	Agilent טכנולוגיות, Inc.	5065-4401	משמש לטעינת מטריצת ג'ל לתוך שבב עם מזרק המסופק עם כל ערכת בדיקה - המשמש לבדיקות RNA, DNA וחלבונים. כולל תחנת פריימינג, שעון עצר וקליפס מזרק אחד
ערכת ניקוי אלקטרודות	Agilent טכנולוגיות, Inc.	5065-9951	מונע זיהום צולב. מסיר מזהמים חיידקיים או חלבוניים מאלקטרודות.
מסננים למטריצת ג'ל	Agilent טכנולוגיות, Inc.	185-5990	משמש לערבוב נכון של תרכיז צבע DNA ומטריצת ג'ל DNA
מערבולת שבבים בסיסית IKA	IKA-Werke GmbH ושות' ק ג	MS-3-S36	משמש לערבוב נכון של סולם DNA ודגימת DNA על שבבי בדיקת Bioanalyzer
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה
אתנול (96-100%)
בלוק חימום או דומה ב 56 ° C (מסוגל להחזיק צינורות איסוף 2 מ"ל)
מלח חוצץ פוספט (PBS)
פיפטות (מתכווננות)
טיפים פיפטה סטרילית (טיפים פיפטה עם מחסומי תרסיס מומלצים כדי לסייע במניעת זיהום צולב)
אמבט מים או בלוק חימום המסוגלים להחזיק צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ב 60 ° C