תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית: שיטה ליצירת תגובות PCR ננו-טיפתיות לאיתור מוטציות סרטניות נדירות

תקציר

מקור: Bonner, E. R. et al. איתור וניטור של DNA הקשור לגידול במחזור הדם בנוזלים ביולוגיים של מטופלים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מציגים הליך שלב אחר שלב ליצירת ננו-טיפות מתחלבות לזיהוי חומצות גרעין מטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית או dPCR.

פרוטוקול

1. איתור וכימות של DNA המטרה באמצעות dPCR

1. הכינו את תערובת תגובת dPCR עבור 8 בארות של צינור רצועת PCR בתוספת 10% תוספת, על ידי הוספת 220 μL של תערובת מאסטר גנוטיפ, 8.8 μL כל אחד של 10 μM wildtype ובדיקות מוטנטיות, 39.6 μL כל אחד של 10 μM פריימרים קדימה ואחורה, ו 17.6 μL של שמן מייצב טיפות.
2. ערבבו בעדינות את תערובת תגובת dPCR על ידי פיפטציה של עוצמת הקול המלאה למעלה ולמטה 10-20 פעמים. אין לערבל או לצנטריפוגה לאחר הוספת שמן מייצב טיפות לתערובת התגובה.
3. השג צינור רצועת PCR 8-well ושחרר 38 μL של תערובת תגובת dPCR ישירות לתחתית כל באר. הסר את כל הבועות עם קצה פיפטה נקי.
   הערה: צינורות רצועת PCR המשולבים זה בזה או ארוזים היטב זה לזה עלולים לגרום למטענים חשמליים סטטיים, ולגרום להתלכדות ולאות רועש בעת ניתוח נתוני dPCR. כדי להימנע מכך, יש לדחוס את הצינורות לשקיות נפרדות של סיכון ביולוגי, להימנע מאריזת יתר של השקיות, ולמנוע מהצינורות להתחכך זה בזה.
4. הוסף 12 μL של דגימת DNA מוגברת מראש לבארות המתאימות של צינור רצועת PCR. עבור הבקרה השלילית, הוסף 12 μL של MB H₂O.
   הערה: נתח דגימות cfDNA בבארות משוכפלות. עבור CSF, לנתח לפחות כפול, ועבור פלזמה / סרום לנתח כל דגימה משולשת.
5. יש לערבב בעדינות את הנפח המלא למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב את תערובת התגובה עם דגימת הדנ"א.
6. השג שבב מכשיר חדש המייצר טיפות ופיפטה את הנפח המלא מבארות 1-8 של צינור רצועת ה- PCR לתעלות המתאימות A-H בשבב. הימנעו מנגיעה בתחתית התעלות עם קצה פיפטה.
7. השג צינור רצועת PCR נקי חדש והכנס למכשיר המייצר טיפות. סרוק או הזן ידנית את מזהה שבב המכשיר המייצר טיפות לתוכנה במחשב המכשיר. הזן שמות עבור כל אחד מ- 8 הערוצים. לחץ על התחל את הריצה כדי להתחיל ב- dropletizing samples.
8. לאחר השלמת הטיפה, הסר את צינור רצועת ה- PCR והחל מכסי צינור רצועה.
9. מעבירים את צינור הרצועה למחזור תרמי ומאוזנים עם צינור רצועה אחר המכיל 80 מיקרוליטר מים לכל באר.
10. תכננו את תנאי המחזור התרמי כ: 95°C למשך 10 דקות; 45 מחזורים של שתי טמפרטורות: 95°C למשך 30 שניות וטמפרטורת חישול למשך 2 דקות; 98°C למשך 10 דקות; והחזיקו ב-10°C.
    1. הגדר את קצב הרמפה ל- 0.5 ° C/s והגדר את נפח הדגימה ל- 80 μL.
11. כאשר המחזור התרמי הושלם, הסר את צינור הרצועה והעבר למכשיר הכימות. הסר מכסי רצועות PCR והחלף במכסות מהירות גבוהה.
12. הפעל את מכשיר הכימות ואת המחשב המחובר באמצעות תוכנת המכשיר. הפעל את תוכנת המכשיר ולחץ על הגדר ריצה.
13. הכניסו את צינור הרצועה למכשיר הכימות.
14. השג שבב מכשיר כימות חדש וסרוק או הזן ידנית את מזהה השבב לתוך המכשיר. הכנס את השבב למכשיר.
15. הניחו את מגן המתכת על גבי השבב וסגרו את מכסה המכשיר.
16. בתוכנת המחשב, הזן שם עבור הפעלת dPCR ועבור כל אחד מ- 8 הערוצים (A-H). בחר מצב מהיר (שבו יש להשתמש עם מכסות מהירות גבוהה) ולחץ על התחל כדי להתחיל בכימות.
17. לאחר השלמת הכימות, הסר את מגן המתכת (לשמירה ולשימוש חוזר) והשלך את צינור רצועת ה- PCR ואת השבב. במחשב המכשיר, יומן ההפעלה יכיל קבצי תוצאות עבור כל ריצה. השתמש בקבצי .fcs עבור כל דוגמה כדי לנתח באמצעות תוכנת האנליסט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת Raindance מתכלה	ביו-ראד	20-04411	מכיל שבבי מכשירים לייצור טיפות, שבבי מכשירי כימות, מכסי רצועות PCR כולל כובעים במהירות גבוהה ושמן מייצב טיפות
Raindance Sense Instrument	ביו-ראד		מכשיר כימות
Raindance Source Instrument	ביו-ראד		מכשיר ליצירת טיפות
תוכנת RainDrop Analyst II	RainDance טכנולוגיות		תוכנת אנליסטים המשמשת לניתוח נתונים
תרמומיקסר C	אפנדורף	14 285 562PM
MiniAmp Thermal Cycler	תרמופישר סיינטיפיק	A37834
PCR 8 כובעי צינור רצועת באר	VWR	10011-786
PCR 8 צינורות רצועת באר	אקסיגן	PCR-0208-C
Q5 התחלה חמה נאמנות גבוהה 2x מאסטר מיקס	ניו אינגלנד Biolabs Inc	M0494S