הכנת פיגום זרעי MSC: טכניקה להכנת פיגומים עם תאי גזע מזנכימליים להשתלה כירורגית במודל מורין

תקציר

מקור: Sheets, K. T. et al. Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seed Scaffolds. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של זריעת תאי גזע מזנכימליים (MSCs) על פיגום פולי(חומצה לקטית) מתכלה (PLA). את הפיגומים המוכנים ניתן להשתיל בחלל הכריתה הכירורגית של המוח, משם הם עשויים לנדוד לעבר מוקדי הגידול. יתר על כן, תאים אלה יכולים להיות מהונדסים לבטא חלבונים טיפוליים כדי לעורר אפופטוזיס בתאים סרטניים.

פרוטוקול

1. תרבית תאים והכנת פיגומים

הערה: יש להכין פיגומים 48 שעות לפני ההשתלה בעכברים. הכרכים הבאים מסופקים על בסיס פיגום. הכפלת כמויות לפי הצורך עבור פיגומים נוספים.

1. חתכו פיגומים פולי(חומצה לקטית) (PLA) לחתיכות בגודל חלל כריתה (כ-2 מ"מ x 2 מ"מ). פיגומים ניתן לחתוך ביד באמצעות מספריים או באמצעות ניקוב חור עבור חזרתיות.
2. יש לעקר על ידי טבילה באתנול 70% למשך 15 דקות ולאחר מכן לטבול ב-PBS. הניחו פיגום בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין תוך הכנת תאים לזריעה.
3. הרימו MSCs בתרבית באמצעות 0.05% טריפסין (3-5 מ"ל עבור צלוחיות T75). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. ודא שהתאים התרוממו, ולאחר מכן הוסף 7-10 מ"ל DMEM לבקבוק כדי להשבית טריפסין.
4. מעבירים את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. גלולה 5 x 10⁵ MSCs לכל פיגום באמצעות צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות.
5. לשאוף supernatant ולהשהות מחדש MSCs ב 5 μL DMEM לכל 5 x 10⁵ תאים.
6. הכינו את הפיגומים לזריעה על ידי ייבוש בטפיחות קלות.
   1. הסר פיגום מטבילה DMEM עם מלקחיים והנח אותו באופן זמני על מכסה צלחת 6 בארות. הרם את הפיגום מהמכסה, משאיר אחריו טיפה של DMEM עודף.
   2. החזירו את הפיגום למכסה שוב במקום חדש ויבש. חזרו על הפעולה 3-5 פעמים, ואז הניחו את הפיגום המיובש חלקית בצלחת חדשה בת 6 בארות לזריעה. חזור על הפעולה עבור כל פיגום.
      הערה: פיגום מיובש חלקית מספק תוצאות אופטימליות של זריעת תאים. אם הפיגום רטוב מדי, התאים יחליקו מהפיגום וייצמדו לצלחת הבאר שמתחת. אם הפיגום יבש מדי, הטיפה לא תתפשט על כל הפיגום וכתוצאה מכך פיזור התאים הראשוני יהיה לקוי.
7. בעזרת פיפטה, מערבבים בעדינות את בקבוקון תאי הגזע כדי ליצור הומוגניות של התרחיף, שכן ייתכן שחלק מהתאים התיישבו בתחתית.
8. לאט פיפטה 2.5 μL מתלה MSC טרי מעורבב ישירות על הפיגום ויוצר טיפה קטנה מעל החלק העליון של הפיגומים.
9. הוסף 300 μL DMEM לקצוות של כל באר. זה ימנע אידוי מהיר של טיפת התא. דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ומאפשרים לתאים להיצמד לפיגומים.
10. בעזרת מלקחיים, הופכים בעדינות את הפיגומים בצלחת הבאר. זרעים 2.5 μL תרחיף MSC טרי מעורבב (התוצאה היא סך של 5 x 10⁵ תאים זרע לכל פיגום). דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ומאפשרים לתאים להיצמד לפיגומים.
11. מכסים את הפיגומים ב- DMEM על ידי הוספת 2 מ"ל לכל באר של צלחת 6 הקידוחים. הרימו בעדינות את הפיגומים כדי לאפשר למדיה לזרום מתחתם. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C במצב זה במשך 48 שעות לפני ניתוח ההשתלה.
12. בדוק את הפיגומים לאחר 24 שעות והוסף / שנה מדיה אם נצפה אידוי עודף או מדיה דהויה עקב חוסר איזון pH.