כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. תיוג תאי גליובלסטומה עם מבנה FP635 או FP720
- לייצר ולטהר lentivirus על פי הפרוטוקול המתואר להלן:
- שימו לב למנות שנזרעו ביום הראשון. כאשר התאים הם 80-90% confluent הם מוכנים transfection.
הערה: לתאים עדיין צריך להיות מקום לעבור 1-2 חלוקות תאים
- הכינו את תערובת הפלסמיד על ידי חיבור ארבעת הפלסמידים לצינור של 50 מ"ל. להכנת צלחת של 12 × 15 ס"מ, יש להשתמש ב-270 מיקרוגרם של וקטור העברה, 176 מיקרוגרם של pMDL (Gag/Pol), 95 מיקרוגרם של pVSVG (גליקופרוטאין של וירוס סטומטיטיס שלפוחיתיים) ו-68 מיקרוגרם של pREV.
- מכינים 13.5 מ"ל של 0.25M CaCl2 (לדלל עם ddHמסונן 2O) ולהוסיף לתערובת פלסמיד. הוסף 13.5 מ"ל 2× פתרון BBS. מערבבים בעדינות על ידי היפוך מספר פעמים ודגרים 15 דקות בטמפרטורת החדר (22-26°).
- מוסיפים את תערובת הטרנספקציה (ממרחים בטיפות) לכל צלחת (2.25 מ"ל לצלחת). מערבלים את הצלחות בעדינות ודגרים ב-3% CO2, 37°C למשך הלילה (16-20 שעות).
- התבוננו בתאים. הם צריכים להגיע למפגש. אם קיים סמן גלוי (כגון GFP) בפלסמיד העדשים, ניתן להעריך את יעילות הטרנספקציה באופן חזותי. באופן אידיאלי, יעילות transfection צריך להיות >90%.
- הסר מדיה, הוסף 15 מ"ל של DMEM טרי + 2% FBS לכל צלחת ולהעביר ל 10% CO2, 37 ° C. לדגור לילה.
- אספו את הקציר הראשון של סופרנטנט: אספו ואגרו סופרנאטנט (12 מנות × 15 מ"ל לצלחת = 180 מ"ל) מהכלים.
- הוסף 15 מ"ל DMEM טרי + 2% FBS לכל מנה. לדגור על מנות ב 10% CO2, 37 ° C במשך הלילה. את הכלי המכיל את הסופרנאטנט הלנטיוויראלי יש להכניס להכלה משנית (שקית ניילון אטומה תעשה) ולאחסן ב -4 מעלות צלזיוס.
- ריכוז ההכנה הנגיפית: ריכוז החלקיקים הנגיפיים על ידי אולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה הסופרנאטנט ב 70,000 x גרם במשך 2 שעות ב 20 ° C. צינורות חרוטיים (בניגוד צינורות תחתונים עגולים) ורוטורים דלי מתנדנד (בניגוד לרוטורים בעלי זווית קבועה) מומלצים (פשוט מכיוון ששילוב זה מקל על איתור הגלולה הכמעט בלתי נראית). אנו משתמשים בצינורות חרוטיים עם רוטור Beckman SW28 (קיבולת לשישה צינורות) ב 19,400 סל"ד למשך שעתיים ב 20 ° C. מלא את הצינורות עם 30 מ"ל של supernatant. הנפח הכולל של supernatant מ 12 × 15 ס"מ הכנת צלחת הוא 360 מ"ל; לכן, עיבוד הנפח המלא ידרוש שני סיבובים רצופים. לטעון את הצינורות, לעשות את הסחרור הראשון, לשפוך את supernatant מבלי להפריע את הכדור, לטעון מחדש עם supernatant ויראלי טרי ולבצע את הסחרור השני.
- יוצקים את הסופרנאטנט ומאפשרים לנוזל שנותר להתנקז על ידי הנחת הצינורות ההפוכים על מגבות נייר. יש לסנן את הטיפות הנותרות באמצעות שואב על מנת להסיר את כל הנוזלים מהכדורית. הגלולה צריכה להיות בקושי נראית כנקודה שקופה קטנה.
- להשעות מחדש את הכדורים הנגיפיים ב 100 μL של 1× HBSS. הימנעו מהקצפה. שטפו את הצינורות עם 100 μL של 1× HBSS. אחסן את שני אמצעי האחסון לקבלת נפח סופי של 200 μL.
- מעבירים לצינור מיקרופוגה עם מכסה בורג, עוטפים בפרפילם ובמערבולת במהירות נמוכה למשך 15-30 דקות. התכשיר הנגיפי המושהה ייראה בכל מקום בין שקוף לחלבי מעט.
- נקה את המתלה על ידי סיבוב במשך 10 שניות על מיקרוצנטריפוגה שולחנית. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרופוגה חדש עם מכסה בורג. הפוך 20 μL aliquots של supernatant. סופרנאטנט ויראלי זה הוא באיכות של כיתה חוץ גופית.
- תרבית כ 2.0 x 106 תאים מקו תאי גליומה אנושי עם DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) בצלחת 15 ס"מ; או תרבית 2.0 x 106 כדורי גליובלסטומה אנושיים (GBM-PDX) עם מדיום DMEM/F12 1:1 עם תוסף B27 בתוספת גורם גדילה אפידרמיס רקומביננטי אנושי (EGF; 20 ננוגרם/מ"ל) ו-FGF (10 ננוגרם/מ"ל) בצלוחית T75.
- שמור על כל התאים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 ו-100% לחות יחסית.
- נתק את התאים.
- עבור תאי גליומה: להסיר את supernatant מן הצלחות והוספת 3-5 מ"ל של טריפסין 1X לתאי גליומה.
- עבור כדורי GBM: לאסוף את התאים על ידי pipeting התאים לתוך צינור 15 מ"ל.
- סובב את כדורי GBM במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחנית בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים 3-5 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים.
- יש לדגור על כל התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 10-15 דקות.
- בזהירות לנתק את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה מספר פעמים (להבטיח כי כדורים ותאי גליומה הושלמו מנותקים) ו להסתובב למטה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את התאים עם 5 מ"ל של בינוני על ידי pipeting למעלה ולמטה מספר פעמים. קבע את כדאיות התא על-ידי אי הכללת כחול טריפאן.
- צלחת 1.0 x 106 של תאי מטרה בצלחת 10 ס"מ עם 5 מ"ל של בינוני על ידי pipetting.
- לתמר תאים עם lentivirus המבטא חלבונים פלואורסצנטיים בריבוי של זיהום (MOI) 5 ולדגור ב 37 ° C.
- לאחר 24 שעות, להסיר את התווך מן התאים מותמרים, להוסיף 5 מ"ל של מדיום טרי, לדגור במשך 48 שעות נוספות ב 37 ° C.
- נתק את התאים הנגועים לתרחיף חד-תאי באמצעות טריפסין כמתואר לעיל. סובב את התאים במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות והשהה מחדש ב- 500 μL של תמיסת מיון (מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 1% FBS).
- פיפטה את תרחיף התא לתוך צינורות FACS. לצבוע את התאים עם 1 μL / מ"ל של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride כדי להוציא תאים מתים. בקרות שליליות נדרשות כדי להגדיר את שערי ציטומטר הזרימה (תאים שאינם מתמרים ותאים שאינם מומרים / מוכתמים ב- DAPI).
- מיין את התאים הפלואורסצנטיים-חיוביים/DAPI-שליליים לתמיסת מיון ואסוף את התאים הממוינים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- סובבו את התאים הממוינים ב 200 x גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש ב 5 מ"ל של מדיום תרבית. זורעים את התאים הממוינים בכלי בקוטר 10 ס"מ על ידי פיפטינג. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 48-72 שעות לפחות.
- הרחב את התאים הממוינים על ידי ניתוק התאים כמתואר לעיל וציפוי לכלים מרובים לניסויי in vivo.
