בדיקת נדידת תאי גזע של גידול במוח (BTSC) למחקרי טיפול תרופתי: טכניקת הדמיה חוץ גופית של תאים חיים לניתוח ההשפעה של טיפול תרופתי על נדידת BTSC

תקציר

מקור: Restall, I. et al. בדיקות הדמיה של תאים חיים לחקר נדידת תאי גזע של גידול במוח גליובלסטומה ופלישה. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת נדידת תאי גזע של גידול במוח כדי לנתח את ההשפעה של התרופה המעניינת על נדידת תאי גזע חיים של גידולי מוח באמצעות צלחת נדידת כימוטקסיס. הדמיה של תאים חיים מאפשרת הדמיה וכימות של נדידת תאים במהלך הבדיקה.

פרוטוקול

1. בדיקת נדידת תאי גזע של גידול במוח

1. זרעו 200,000 תאים בבקבוק T25 ב 8 מ"ל של מדיה מלאה 1-2 שבועות לפני תכנון לבצע בדיקת נדידה.
   הערה: הזמן בין ציפוי לביצוע הבדיקה ישתנה בהתאם לקצב הצמיחה של תרבות BTSC בשימוש.
   1. כדי לבחון את ההשפעה של טיפול תרופתי על הגירה, טפל בתאים עם הרכב המתאים, כגון DMSO, ותרופה מעניינת על ידי הוספת נפחים רלוונטיים של הרכב או מלאי התרופות ישירות לבארות נפרדות של מדיה המכילות את התאים.
2. הכינו את צלחת הנדידה של כימוטקסיס (איור 1A) על-ידי ציפוי שלה בשכבה דקה של קולגן.
   1. חשב את מספר הבארות של צלחת כימוטקסיס 96 בארות כי יהיה צורך לצפות קולגן. כלול לפחות שלוש בארות משוכפלות לכל מצב.
   2. יש לדלל 5 מ"ג/מ"ל מלאי של קולגן מסוג I ל-0.2 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית טהורה מדוללת ל-0.14% במים בדרגת תרבית.
   3. פיפטה 0.2 מ"ג / מ"ל של קולגן הן לבארות החדרת הממברנה והן לבארות המאגר התחתונות שנמצאות בשימוש.
      הערה: המאגרים התחתונים של הצלחת דורשים 225 μL ובארות החדרת הממברנה דורשות 75 μL קולגן לציפוי תקין.
   4. מניחים את לוחית הנדידה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. שאפו את תמיסת הקולגן מהבארות מבלי לגרד את ציפוי הקולגן.
   5. לשטוף את הבארות 2x עם סטרילי 1x PBS. אם הצלחת אינה בשימוש מיידי, שאפו את PBS ואחסנו אותה ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. לפני השימוש, חממו את צלחת הנדידה של הכימוטקסיס לטמפרטורת החדר.
3. הכינו את המאגר התחתון של צלחת הנדידה של הכימוטקסיס.
   1. פיפטה 225 μL של מדיה (ללא גורמי גדילה), בתוספת 10% FBS כמו chemoattractant, לבארות המאגר התחתון של צלחת ההגירה chemotaxis.
   2. הניחו בעדינות את הממברנה במאגר התחתון בזווית כדי למנוע יצירת בועות.
4. לוחצים את התאים לתוך החדרת הממברנה של צלחת הנדידה של כימוטקסיס.
   1. השהיה מחדש של BTSCs מנותקים במדיה (ללא גורמי גדילה) בצפיפות תאים של 50,000 תאים / מ"ל. הוסף תרופות לתקשורת אם אתה מעריך הגירה במהלך טיפולים תרופתיים שונים. לחילופין, זרעו מספר שווה של תאים שטופלו מראש ותאי בקרה, תוך שמירה על ריכוז התרופה הסופי בעת הציפוי.
   2. צלחת 50 μL של BTSCs משלב 1.4.1 לכל באר של צלחת הנדידה בתנאי הטיפול הרצויים.
5. דמיינו את נדידת הכימוטקסיס.
   1. הניחו את לוחית הנדידה של הכימוטקסיס במערכת ההדמיה של התא החי וכוונו את תוכנת ההדמיה האוטומטית לקבלת תמונות מיקרוסקופיות של הצלחת כל 1-2 שעות למשך עד 72 שעות. באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים), לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן והגדר את מרווח הסריקה לכל שעתיים למשך 24 שעות
      הערה: מרווח הזמן והזמן הכולל שחלף ישתנו בין תרבויות BTSC בשימוש; התחל עם מרווחים של שעתיים למשך 72 שעות עד שנצבר ניסיון עם תרבויות BTSC בודדות. אם מערכת הדמיה אוטומטית אינה זמינה, ניתן לרכוש תמונות של אותו שדה ראייה באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ ומצלמה המחוברת לתוכנת ההדמיה.
   2. לאחר השלמת רכישת התמונה, השיגו את התמונות עבור הניסוי כולו וצרו הגדרת עיבוד באמצעות תוכנת הניתוח שמבדילה תאים מהרקע של הממברנה ונקבוביות הנדידה (איור 1B, מסיכה אדומה). באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים), בחר הגדרת עיבוד חדשה והגדר את הגדרות הגדרת העיבוד עבור BTSC לסף זרעים של 52, סף גידול של 85, התאמות של הגודל (פיקסלים) ב- -1 ושטח מינימלי של 200 מיקרומטר². החל הגדרת עיבוד זו על הצד התחתון של הממברנה. שנה ניתוח זה אם הוא אינו מבדיל במדויק בין תאים לבין קרום הרקע.
   3. אספו נתונים כשטח הפנים של התא בצד התחתון של הממברנה עבור כל אחת משלוש הבארות המשוכפלות, אשר סופרות רק את התאים שנדדו דרך הנקבוביות. הציגו גרף של נדידת התאים במיקרומטר² (שטח התאים שהועברו) לאורך זמן (איור 1C).
      הערה: ודא שהמספר היחסי של התאים המצופים והנספרים על פני השטח העליונים של הממברנה בנקודת הזמן הראשונה דומים (פחות מ -20% שונות בכל הבארות) בין כל תנאי הטיפול כדי למנוע השפעות של ציפוי לא אחיד. איסוף נתונים באמצעות התוכנה המסחרית (ראה טבלת חומרים) יכול להתבצע על ידי הפעלת הגדרת העיבוד שנוצרה בשלב 1.5.2, לחיצה על מדדים, לאחר מכן על גרף/יצוא, ולאחר מכן על ייצוא נתונים.

תוצאות

איור 1: הדמיה של תאים חיים של נדידת BTSC. (A) זוהי דוגמה ללוחית נדידת כימוטקסיס בת 96 בארות המצופה בשכבה דקה של קולגן מסוג I לפני ביצוע בדיקת הנדידה עם BTSC. התמונות מראות i) לוח שכל שלושת החלקים (מכסה, תוספת קרום ומאגר) מונחים יחד, ii) כל שלושת החלקים מופרדים, iii) תמונת תקריב של התצוגה העליונה של הוספת הממברנה, iv) תמונת תקריב של התצוגה התחתונה של הוספת הממברנה, v)...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריצת מטריגל	קורנינג	356230
צלחות 96 בארות	אפנדורף	30730119
T25 Nunc EasYFlask	תרמופישר	156367
בז 15 מ"ל צינור חרוטי	תרמופישר	352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis צלחת	אסן ביוסיינס	4582
מערכת ניתוח תאים חיים IncuCyte Zoom	אסן ביוסיינס	4545
תוכנת IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis	אסן ביוסיינס	מהדורה 1 של 2016A
מלח חוצץ פוספט (PBS)	סיגמא	D8537
מים בדרגת תרבית	לונזה ביוויטאקר	17-724Q
סרום בקר עוברי (FBS)	Invitrogen	12483-020
קולגן חולדה I	טרוויגן	3440-100-01
פתרון ניתוק תאי Accumax	טכנולוגיות תאים חדשניות	AM105