1. בדיקת פלישה נוירוספרית של תאי גזע במוח
- זרעו 200,000 תאים ב-8 מ"ל של מדיה שלמה בבקבוק T25 שבוע-שבועיים לפני שאתם מתכננים לבצע ניסוי פלישה.
הערה: העיתוי מציפוי לביצוע הבדיקה יהיה תלוי בקצב ההתפשטות של תרבות BTSC בשימוש.
- עבור תאים שטופלו מראש, הוסף את תרכובת העניין לבקבוק בריכוז הרצוי עבור מהלך הזמן שנקבע מראש לפני שהנוירוספרות מוכנות לציפוי לפלישה.
- המתן עד שהגודל הממוצע של הנוירוספר הוא בערך 150-200 מיקרומטר; בדרך כלל, זה לוקח 7-14 ימים, בהתאם לתרבות BTSC בשימוש.
הערה: זה אופייני לראות התפלגות של גדלי כדור בצלוחית.
- טיפ בעדינות לערבב את הבקבוק עם פיפטה ולהעביר 500 μL של נוירוספרות BTSC לצינור חרוטי 1.5 מ"ל עבור כל תנאי טיפול; זה ישמש כדי צלחת שלוש בארות משוכפלות.
הערה: שלבים 1.3.1–1.3.2 הם אופציונליים אך מומלצים לניסוי הפלישה הראשון בתרבות BTSC חדשה.
- כדי לקבוע את צפיפות הנוירוספרות שיגיעו בסופו של דבר לבאר, הכינו צינור של 1.5 מ"ל כמו בשלב 1.3. ערבבו בעדינות את הנוירוספרות והעבירו 100 מיקרוליטר לצלחת נפרדת בת 96 בארות ואפשרו לנוירוספרות להתיישב על ידי כוח הכבידה למשך 5 דקות.
- בדוק את מספר הנוירוספרות מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שנוירוספרות מרובות נמצאות באזור הבאר שתוצלם מבלי להעמיס עליה צפיפות.
הערה: נוירוספרות פולשות דורשות מספיק מקום כדי לשלש את קוטרן מבלי ליצור אינטראקציה עם נוירוספרות שכנות. ניתן לכוונן את מספר הנוירוספרות לכל באר על ידי ספירת מספר הנוירוספרות לכל באר והוספת יותר או פחות נוירוספרות מבקבוק T25 לצינור החרוטי של 1.5 מ"ל בשלב 1.3.
- מניחים את הצינור החרוטי בנפח 1.5 מ"ל עם התאים משלב 1.3 על קרח ומבצעים את שלבים 1.5-1.7 על קרח.
- תן לנוירוספרות לשקוע על ידי כוח הכבידה לתחתית הצינור החרוטי 1.5 מ"ל במשך 5 דקות ו prechill צלחת מסומן 96 באר על קרח.
- השהה מחדש את הנוירוספרות בחלבון המטריקס החוץ תאי.
- הכינו 500 μL של תמיסת קולגן מסוג I 0.4 מ"ג/מ"ל על קרח עבור כל תנאי טיפול: הוסיפו 459 μL של מדיה (ללא גורמי גדילה), 40 μL של תמיסת קולגן 5 מ"ג/מ"ל, ו-0.92 μL של NaOH 1N סטרילי (טבלה 1).
הערה: 500 μL של תמיסת הקולגן נדרשים לכל תנאי טיפול: 100 μL עבור כל אחת משלוש הבארות המשוכפלות ו 200 μL של עודף. טיפולים תרופתיים יש להוסיף כאן בריכוז הסופי הרצוי, מופחת מרכיב המדיה של הפתרון. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בקולגן מסוג I כחלבון מטריצה חוץ-תאי; עם זאת, ניתן לבדוק כל חלבון מטריצה חוץ-תאי. בנוסף, עבור תרבויות BTSC שיש להם שיעורים איטיים יותר של פלישה, גורמי צמיחה או FBS ניתן להשלים בתקשורת כדי להגדיל את שיעור הפלישה.
- לאחר שהנוירוספרות משלב 1.5 התיישבו, שאפו כמה שיותר מהמדיה מבלי לאבד את כדור הנוירוספירה שהתיישב בתחתית. בעדינות להשעות מחדש את הנוירוספרות ב 500 μL של תמיסת קולגן מוכן בשלב 1.6.1.
- הוסף 100 μL של תערובת קולגן ונוירוספר לשלוש בארות משוכפלות של צלחת 96 בארות על קרח. אפשרו לנוירוספרות להתיישב על קרח למשך 5 דקות.
- מעבירים את הצלחת בעלת 96 הבארות לאינקובטור של 37°C למשך 5 דקות כדי לאפשר פילמור קולגן.
- מיד להתכונן לדמיין את צלחת 96 באר.
- הניחו את הצלחת בת 96 הבארות במגש של מערכת הדמיה של תאים חיים או על במת מיקרוסקופ כדי לקבל תמונה כהתייחסות לגודל הנוירוספירה בזמן הציפוי, לפני תחילת הפלישה.
- רכוש תמונות כל שעה עד שקצב הפלישה התייצב; בדרך כלל, זה קורה בתוך 24 h.
הערה: ניתן לשנות את מרווח ההדמיה בהתאם לציוד המשמש. מרווח ההדמיה והזמן הכולל שחלף יכולים להשתנות גם עבור תרבויות BTSC שיש להן שיעורי פלישה שונים.
- קבע את שטח הפנים הגדל של BTSCs כאשר הם פולשים למטריצה לאורך זמן.
הערה: שטח הפנים של התאים בזמן הציפוי, המחושב כממוצע של שלוש בארות משוכפלות, צריך להיות דומה (פחות מ -20% שונות על פני כל הבארות) בין תנאי הטיפול השונים כדי להבטיח שההבדלים בפלישת BTSC לא יושפעו מאוד ממספר או גודל הנוירוספרות המצופות.
- עבור מערכת ניתוח תאים חיים, השתמש במטרה של פי 10 לרכישת התמונה ורכוש ארבע תמונות לכל באר עבור שלוש הבארות המשוכפלות. כדי לקבוע את שטח הפנים היחסי של התא, המיוצג כמפגש האחוזים של הבאר, הגדר הגדרת עיבוד המדגישה באופן ספציפי את התאים על רקע הבאר. באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים), בחר הגדרת עיבוד חדשה והגדר את התאמת הסגמנטציה ל- 0.8, את השטח המינימלי ל- 300 מיקרומטר2 ואת האקסצנטריות המרבית ל- 0.99. שנה ניתוח זה אם הוא אינו מבדיל במדויק בין תאים לבין הרקע.
הערה: אם משתמשים בשיטות אחרות כדי לדמות פלישה נוירוספרית לאורך זמן, מומלץ להשיג שדות ראייה מרובים עבור שלוש הבארות המשוכפלות לאורך זמן. עם זאת, אי הדמיה של אותו שדה ראייה בדיוק בכל מרווח זמן תגדיל את שגיאת התקן של הנתונים שנאספו. ניתן להשתמש בתוכנת מחשב כדי לסייע במדידת שטח הפנים של התאים הפולשים בכל תמונה.
- אסוף נתונים כשטח הפנים הכולל של התא (יחסי או מוחלט) עבור כל באר בכל נקודת זמן וקבע את הממוצע של שלוש הבארות המשוכפלות. גרף את הפלישה של BTSCs על ידי שרטוט שטח התא גדל לאורך זמן.
| הכנת תמיסת קולגן |
| מלאי [קולגן] (מ"ג/מ"ל) | 5 |
| סופי [קולגן] (מ"ג/מ"ל) | 0.4 |
| מספר הבארות הדרושות: | 5 |
| נפח כולל (μL) | 500 |
| נפח מלאי הקולגן (μL) | 40 |
| נפח של 1N NaOH (μL) | 0.92 |
| נפח המדיה (μL) | 459 |
טבלה 1: הכנת תמיסת קולגן מסוג I במינון 0.4 מ"ג/מ"ל. ברשימה מופיעים הריכוזים הסופיים ההתחלתיים והרצויים של תמיסת קולגן מסוג I. הנפחים המפורטים מספיקים כדי לחבר נוירוספרות לשלוש בארות משוכפלות, ועוד שתיים עבור עודף, ויכולים לכלול תנאי טיפול יחיד, כפי שמתואר בפירוט בשלב הפרוטוקול 1.
