תרבית משותפת של תאי גליובלסטומה על תאי עצב בעלי תבנית: טכניקה לניטור נדידת תאי גליובלסטומה על תאי עצב בהיפוקמפוס חולדה במבחנה

תקציר

מקור: Guyon, J. et al. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מתאר ניסוי תרבית משותפת של תאי גליובלסטומה על נוירונים מיקרו-דפוסיים, המחקים את פלישת תאי הגזע דמויי הגליובלסטומה לדרכי העצב המיאלינטיות כשהם נודדים על תאי עצב בחללים הפריטומורליים. בדיקה זו יכולה לסייע בניתוח ההשפעות של תרופות פרמקולוגיות המעכבות נדידת תאי גליובלסטומה על נוירונים בגליומה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת השקופיות עם הדוגמאות

1. הכנת המצע למיקרו-דפוסים
   1. יש לטפל בכיסויי זכוכית עגולים בקוטר 18 מ"מ על ידי הפעלת אוויר/פלזמה למשך 5 דקות. הניחו את הכיסויים בתא סגור עם 100 מיקרוליטר של (3-אמינופרופיל) טריאתוקסיסילן במייבש למשך שעה אחת.
   2. יש לדגור עם 100 מ"ג/מ"ל פולי (אתילן גליקול)-סוקסינימידיל ולרט (משקל מולקולרי 5,000 (Peg- SVA)) במאגר פחמתי של 10 mM, pH > 8, למשך שעה אחת. יש לשטוף באופן נרחב במים טהורים במיוחד ולייבש תחת מכסה מנוע כימי.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך לשימוש נוסף.
   3. הוסף את יוזם הצילום, 4-בנזואיל בנזואיל טרימתילאמוניום כלוריד (PLPP), ב 14.7 מ"ג / מ"ל במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
      הערה: ניתן להשתמש גם בצורה מרוכזת של PLPP, ג'ל PLPP. התוצאה היא זמן הארה אולטרה סגול (UV) קצר יותר הדרוש כדי לפרק את מברשת ה-PEG (100 mJ/mm²).
2. Photoinitiator ג'ל תצהיר
   1. הכינו תערובת של 3 μL של ג'ל PLPP ו 50 μL של אתנול מוחלט להפקיד במרכז השקופית. מניחים את הדגימה מתחת למכסה מנוע כימי עד לאידוי מוחלט של האתנול המוחלט.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך לשימוש נוסף.
3. זכוכית שקופיות Micropatterning
   1. הרכיבו את הכיסוי בתא לודין והניחו אותו על הבמה הממונעת של מיקרוסקופ המצויד במערכת מיקוד אוטומטי.
   2. טען תמונות המתאימות למיקרו-תבניות החזויות לתוך התוכנה. החל את הפרמטרים הבאים: שכפול 4 x 4 פעמים, מרווח של 200μm, מינון UV של 1,000 mJ/mm². לאחר רצף תאורת UV אוטומטי, שטפו את ה- PLPP בשטיפות PBS מרובות.
      הערה: אם נעשה שימוש בג'ל PLPP, יש להסיר אותו על ידי שטיפות נרחבות עם מים נטולי יונים, לייבש בזרם של N₂ ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   3. יש לדגור עם למינין (50 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS) למשך 30 דקות. יש לשטוף בהרחבה עם PBS.
      הערה: ניתן לערבב תמיסה פלואורסצנטית של חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר (GFP, 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS) עם למינין כדי להמחיש את המיקרו-תבניות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. הכנת תאי עצב ותאי GBM לתרבית משותפת

1. תרבית של תאי עצב בהיפוקמפוס של חולדה עוברית
   1. נתחו את ההיפוקמפוס של חולדות עובריות (E18) והעבירו את הרקמה לתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)/פניצילין-סטרפטומיצין בתמיסת 15 מ"ל. הסר תמיסה עודפת מבלי לייבש את ההיפוקמפוס.
   2. הוסף 5 מ"ל של טריפסין-אתילאנדיאמין טטרה חומצה אצטית (EDTA) בתוספת פניצילין (10,000 יחידות/מ"ל)/סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מ"מ HEPES, ודגור במשך 15 דקות ב-37°C. שטפו פעמיים בתמיסת HBSS/HEPES/פניצילין-סטרפטומיצין, והניחו לרקמה להישאר בתמיסה זו למשך 2-3 דקות.
   3. נתקו את הרקמה באמצעות שתי פיפטות פסטר מלוטשות להבה, על ידי פיפטציה מעלה ומטה פי 10 עם כל רקמה, תוך הקפדה על מזעור הקצף. ספרו את התאים והעריכו את הכדאיות של השעיית התא. לוחית את הנוירונים על כיסויים micropatterned כפי שמצוין להלן.
      הערה: שיעור הכדאיות של התאים הוא 85-90% לאחר החילוץ.
2. תרבית תאים לתאי עצב על גבי כיסויי מיקרו-תבניות
   1. החזירו לחות לשקופיות זכוכית עם תבנית מיקרו עם PBS ודגרו על מדיום שלם של תרבית תאים עצבית.
   2. זרעו את תאי העצב בהיפוקמפוס המתקבלים מחולדות E18 Sprague-Dawley ישירות על גבי כיסוי זכוכית מיקרו בצפיפות של 50,000 תאים לסמ"ק² בתווך נוירובזאלי (NBM) מועשר בסרום סוס 3%. מקם את הנוירונים micropatterned באינקובטור (37 ° C, 5% CO₂) במשך 48 h.
      הערה: לאחר ~6 שעות, ניתן לראות נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס נצמדים למיקרו-תבניות הלמינין.
3. תרבית משותפת של תאי גזע דמויי GBM אנושיים על תאי עצב
   1. כאשר התאים בצורת ספרואיד גדלים בתרחיף, צנטריפוגו את המתלה למשך 5 דקות ב 200 × גרם. לשטוף את הספרואידים עם 5 מ"ל של PBS, ולדגור את התאים עם 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא (ראה טבלה של חומרים) במשך 5 דקות ב 37 ° C.
   2. הוסף 4.5 מ"ל של NBM מלא (בתוספת תוספת B27, הפרין, גורם גדילה פיברובלסט 2, פניצילין וסטרפטומיצין, כפי שתואר קודם לכן), וספור את התאים באמצעות טכניקת ספירה אוטומטית.
   3. זרעו 1,000 תאי GBM על גבי תרבית עצבית מיקרו-דפוסית ב-NBM מועשר בסרום סוס 3%. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C, 5%_CO2 ו-95% לחות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(3-אמינופרופיל) טריאתוקסיסילן	סיגמא	440140-100 מ"ל	קבוצת האמינו שימושית עבור bioconjugation של mPEG-SVA
צלחת תחתונה עגולה 96 בארות	זארשטדט	2582624	משמש להכנת ספרואידים
אקוטאזה	גיבקו	A11105-01	מאוחסן בטמפרטורה של -20°C (לטווח ארוך) או 4°C (לטווח קצר), אנזים דיסוציאציה כדורית
B27	גיבקו	12587	מאוחסן ב-20°C-, הפשרה לפני השימוש
גורם גדילה פיברובלסט בסיסי	פפרוטק	100-18 ב'	מאוחסן ב-20°C-, הפשרה לפני השימוש
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת	Invitrogen	C10283	רגיל לספירת תאים
כיסויים	מרינפלד	111580	מצע תרבית תאים
מחסניות Dessicator	סיגמא	Z363456-6EA	משמש להפחתת לחות במהלך טיפול (3-aminopropyl) triethoxysilane
DPBS פי 10	פאן ביוטק	P04-53-500	מאוחסן ב-4°C
בקבוק 75 סמ"ר	בז	10497302
HBSS	סיגמא	H8264-500ML
הפרין נתרן	סיגמא	H3149-100KU	מאוחסן ב-4°C
למינין		114956-81-9	מקדם הידבקות עצבית
בקבוק 75 סמ"ר	בז	10497302
הפרין נתרן	סיגמא	H3149-100KU	מאוחסן ב-4°C
תוכנת לאונרדו			טעינה של מיקרו-דפוסים חזויים
תוכנת MetaMorph	התקנים מולקולריים LLC	נה	תוכנה לאוטומציה של מיקרוסקופיה
מתילצלולוז	סיגמא	M0512	מדולל ב-NBM לריכוז סופי של 2%
מדיום נוירובזאלי	גיבקו	21103-049	מאוחסן ב-4°C
עניבה Nikon (S Fluor, 20x/0.75 NA)			מיקרוסקופ הפוך המצויד בשלב ממונע
פניצילין - סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122	מאוחסן ב-4°C
PLPP	נאדיות		Photoinitiator המשמש לפירוק מברשת PEG
פולי(אתילן גליקול)-סוקסינימידיל ולרט (mPEG-SVA)	לייסאן ביו	VA-PEG-VA-5000-5G	משמש כציפוי נגד עכירות
טריפסין-EDTA	סיגמא	T4049-100ML	משמש לניתוק תאים דבקים