בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

תקציר

מקור: Hørlyck, S. et al. תרבית של פריציטים נימיים במוח למדידות סידן ציטוסולי ומחקרי הדמיית סידן.J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מדגימים את ההליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום תאי אנדותל.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. זריעה וטיפוח של נימי בקר

1. יום 0: ערבבו 0.7 מ"ל של קולגן IV עם 6.3 מ"ל של PBS. הוסף את התמיסה לבקבוק T75 והשאר את הבקבוק למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) או השאר אותו למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
2. הסר את תמיסת הקולגן מהבקבוק ושטוף שלוש פעמים עם PBS.
3. הוסף 7 מ"ל של תמיסת עבודה פיברונקטין ולהשאיר את הבקבוק במשך 30 דקות ב RT. לאחר מכן, להסיר את הפתרון fibronectin זרע נימים מיד לאחר מכן.
4. במהלך זמן ההמתנה של 30 דקות, הפשירו בקבוקון אחד של נימים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
5. כאשר הנימים מופשרים, להעביר מיד צינור צנטריפוגה עם 30 מ"ל של DMEM-comp וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם RT. הסר DMEM-comp מן הצינור להשעות מחדש את גלולת נימי ב 10 מ"ל של DMEM-comp טרי.
6. מעבירים את המתלה של 10 מ"ל לבקבוק T75 המצופה ומשאירים את הנימים להיצמד לתחתית הבקבוק למשך 4-6 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב 10% CO₂.
   הערה: קצב גדילת התאים גבוה יותר ועומד על 10% CO₂ ולא 5% CO₂ הרגיל.
7. לאחר 4-6 שעות דגירה בודקים את הבקבוק תחת מיקרוסקופ אור. שברים של נימים צריכים להיות מחוברים כעת לתחתית הבקבוק (איור 1, יום 0).
8. להכין GM ולשאוף את המדיום DMEN-comp בזהירות רבה מן הנימים ולהחליף אותו עם 10 מ"ל של GM טרי.
9. יום 2: הסירו GM מהנימים והוחלפו ב-10 מ"ל GM טרי. צמיחה תאית מהנימים אמורה להיראות במיקרוסקופ אור בשלב זה (איור 1, יום 2-3).

2. בידוד פריציטים ראשוניים מנימי מוח בקר

1. יום 4: בדקו את הנימים תחת מיקרוסקופ אור.
   הערה: הבקבוק צריך כעת להיות בערך 60-70% מתמזג כדי לספק כמות מתאימה של פריציטים (איור 1, יום 4). אם זה לא המקרה; להחליף את GM עם 10 מ"ל של מדיום טרי ולהשאיר את הבקבוק באינקובטור ליום אחר.
2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים בעדינות ב-PBS.
3. מוסיפים 2 מ"ל טריפסין-EDTA מופשר לתאי אנדותל ומשאירים את הבקבוק באינקובטור למשך 1-3 דקות. הוציאו את הבקבוק לעתים קרובות והתבוננו במיקרוסקופ במהלך פרק זמן זה.
   הערה: תאי האנדותל צריכים לעגל ולהתנתק מן הצלוחית; פריציטים צריכים להיות גלויים כתאים עם מורפולוגיה "רפאים" ועדיין להיות מחוברים לפני השטח של הצלוחית. זהו צעד מסובך וחשוב.זה חיוני כדי להסיר את רוב תאי האנדותל כדי למנוע זיהום של מונוקולטורה pericyte, אבל טריפסיניזציה ממושכת יכול גם לנתק את pericytes. זמן הטריפסיניזציה יכול להשתנות מעט מעת לעת, ולכן יש חשיבות עליונה לצפות בבקבוק בתדירות גבוהה עם המיקרוסקופ במהלך הטיפול.
4. טפחו בעדינות על הצלוחית, כאשר תאי האנדותל החלו לעגל כלפי מעלה, כדי לנתק את תאי האנדותל המשוחררים.
5. כדי לעצור את טריפסיניזציה, להוסיף 10 מ"ל של DMEM-comp לצלוחית. שטפו את הבקבוק בזהירות כמה פעמים עם המדיום כדי להסיר את תאי האנדותל. לשאוף את השעיית תאי אנדותל מן הצלוחית. תאי האנדותל יכולים כעת לשמש למטרות אחרות.
6. הוסף 10 מ"ל של DMEM-comp לצלוחית. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ האור כדי לוודא שהפריציטים עדיין קיימים ומחוברים לתחתית. החזירו את הבקבוק לאינקובטור כדי לאפשר לתרבית המועשרת בפריציטים לגדול.
   הערה: חשוב להתבונן בתרבות בימים הבאים. אם עדיין יש מספר לא מבוטל של תאי אנדותל שגדלים, ניתן לבצע טיפול נוסף בטריפסין.
7. אפשר מונוקולטורה pericyte לגדול עם שינוי של DMEM-comp. בינוני כל יומיים. בדקו את גדילת התאים תחת מיקרוסקופ האור (איור 1, יום 8-5).

תוצאות

איור 1: גידול נימים ובידוד של פריציטים.נימים בודדו ממוח בקר טרי ונזרעו בצלוחיות תרבית ביום 0. צמיחה מנימי מוח בקר והבידוד הבא של פריציטים היו במעקב במשך ימים עם מיקרוסקופ אור. יום 4a מראה את צמיחת תאי האנדותל לפני הטיפול בטריפסין להסרת תאי אנדותל ויום 4b מראה את השאריות מיד לאחר הטיפול. יום 8a מראה את מישור המיקוד, שבו נראים שרידי נימים, ואילו יום 8b מתמקד במישור שבו נראית צמיחת הפריציטים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PBS	סיגמא אולדריץ'	D8537	מלח חוצץ פוספט
קולגן IV	סיגמא אולדריץ'	C5533
T-75 בקבוק	סיגמא אולדריץ'	CLS3972
סרום בקר עוברי (FBS)	PAA/GE שירותי בריאות	A15-101
פיברונקטין	סיגמא אולדריץ'	F1141
טריפסין-EDTA	סיגמא אולדריץ'	T4299
מיקרוסקופ אור	אולימפוס	אולימפוס CK2	מיקרוסקופ אור זקוף עם ניגודיות פאזה
DMSO	סיגמא אולדריץ'	471267
הפארין	סיגמא אולדריץ'	H3149
אינקובטור תאים	תרמו פישר
צנטריפוגה	תרמו פישר	Heraeus Multifuge 3SR+	צנטריפוגה סטנדרטית בנפח גדול לסיבוב תאים
מדיום הנשרים המעובדים של דולבקו	סיגמא אולדריץ'	D0819
פניצילין G נתרן/סטרפטומיצין סולפט	סיגמא אולדריץ'	P0781
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	סיגמא אולדריץ'	M7145