בידוד נימי מוח ממוח האדם: שיטה אופטימלית לחילוץ נימי מוח מרקמת מוח אנושית

תקציר

מקור: Hartz, A. M. S. et al. בידוד נימי מוח מוחיים מרקמת מוח אנושית טרייה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מציג את הבידוד של נימי מוח מוחיים מרקמת מוח אנושית טרייה. לאחר מכן ניתן להשתמש בנימים המבודדים כדי ליצור מודל מחסום דם במוח ex vivo.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת דגימת מוח

הערה: איור 1A מציג את תרשים זרימת העבודה של הליך הבידוד כולו המתואר להלן. רקמת המוח האנושית יכולה לנבוע מכל חלק של קליפת המוח וניתן להשתמש בה טרייה או קפואה. רקמת מוח קפואה יכולה להיות מופשרת בטמפרטורת החדר (ללא חיץ; ~ 30 דקות עבור 10 גרם). כדי להשיג תוצאות דומות, רקמת המוח צריכה להתקבל מאותו אזור במוח עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה מותאם לקליפת המוח האנושית הטרייה (מרווח פוסט-מורטם או PMI <4 שעות) שלא הוקפאה.

1. הכנת רקמת מוח אנושית: תעדו את משקל רקמת המוח. כל המספרים בפרוטוקול הבא מתאימים ל-10 גרם של רקמת מוח אנושית טרייה. הניחו את רקמת המוח בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. בזהירות להסיר את כל קרומי המוח עם מלקחיים. השתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן.
2. טחינה של רקמת המוח האנושית: חתכו בזהירות את רקמת המוח וטחנו אותה באזמל. טחון במשך כ 5 דקות (2-3 מ"מ חתיכות). העבירו את רקמת המוח למטחנת הרקמה Potter-Elvehjem. הוסף 30 מ"ל של מאגר בידוד.
   הערה: קשה לראות את פיסות הרקמה הטחונה מכיוון שרקמת המוח הופכת לדייסה בתהליך הטחינה.

2. הומוגניזציה

1. מטחנת רקמות Potter-Elvehjem (חיסול: 150-230 מיקרומטר): הומוגניזציה של כל דגימה עם 100 פעימות במהירות הומוגנייזר של 50 סל"ד. תעד את הזמן כל 25 פעימות ואת הזמן הכולל הדרוש ל- 100 פעימות. ראו טבלה 1 לפרוטוקול הומוגניזציה מוצע; הזמן הכולל להומוגניזציה של 10 גרם של קליפת המוח המצחית האנושית הוא כ-22 דקות. אין לערבב באוויר כדי למנוע בועות.
2. הקפצה הומוגנייזר (חיסול: 80–130 מיקרומטר): העבירו את ההומוגנייזר להקפצה הומוגנייזר על קרח. הומוגניזציה של המתלה עם 20 פעימות (~ 6 שניות / שבץ, סה"כ ~ 2 דקות). הימנעו מבועות.

3. צנטריפוגה

1. להפיץ את הומוגנט המוח באופן שווה לתוך ארבעה צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ולתעד את הנפח הכולל של הומוגנאט. פיזור 50 מ"ל של חיץ שיפוע צפיפות לתוך צינורות הצנטריפוגה (12.5 מ"ל לכל צינור). השתמש 10 מ"ל של חיץ בידוד כדי לשטוף את pestle ו homogenizer ולהפיץ לתוך ארבע צינורות צנטריפוגה (~ 2.5 מ"ל לכל צינור).
2. סגור היטב את צינורות הצנטריפוגות עם מכסים. מערבבים את ההומוגנאט, מדיום שיפוע הצפיפות והחיץ על ידי ניעור נמרץ של הצינורות. צנטריפוגה ב-5,800 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C (רוטור בזווית קבועה); בחר מהירות האטה בינונית כדי לשמור על הגלולה מחוברת לצינור. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל גלולה ב-2 מ"ל של 1% BSA.

4. סינון

הערה: כדי להפריד את הנימים מתאי הדם האדומים ומפסולת תאים אחרים, יש צורך במספר שלבי סינון.

1. רשת 300 מיקרומטר: לאחר השעיית הכדורית, סנן את המתלה דרך רשת 300 מיקרומטר. נימים מסוננים דרך הרשת, בעוד כלי דם גדולים יותר ופסולת מוח גדולה יותר נשארים על הרשת. בזהירות לשטוף את הרשת עם עד 50 מ"ל של 1% BSA. מחק את רשת השינוי.
   הערה: שלב סינון זה מנקה את התרחיף הנימי מכל כלי דם גדולים יותר או גושים של פסולת מוח.
2. מסנן מתח תאים 30 מיקרומטר
   הערה: שלב סינון זה מפריד נימים מתאי דם אדומים ופסולת מוחית אחרת.
   1. פזרו את התסנין הנימי משלב 4.1 על פני חמשת מסנני זן התאים בגודל 30 מיקרומטר (כ-10 מ"ל של מסנן נימי לכל מסנן מתח תא). נימים מעוכבים על ידי מסנן זה, בעוד תאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת מוח קטנה עוברים דרך המסנן ונאספים בתסנין.
   2. שטפו כל מסנן עם 25 מ"ל של 1% BSA. לאחר מכן, יוצקים את כל התסנין על המסנן השישי כדי להגדיל את התפוקה. לשטוף כל מסנן עם 50 מ"ל של 1% BSA; שמור את מסנני מתח התא עם מכיל את הנימים ולזרוק את תסנין.

5. אוסף נימים

1. הפוך את הפילטרים ושטוף את הנימים עם 50 מ"ל של 1% BSA עבור כל מסנן לתוך צינורות 50 מ"ל. הפעילו בעדינות לחץ עם קצה הפיפט של פיפטור 5 מ"ל והעבירו אותו על פני המסנן כדי לשטוף את נימי המוח.
2. הקפידו לשטוף את כל נימי המוח, במיוחד משפת המסנן. הימנעו מבועות מכיוון שזה מקשה על תהליך הסינון ומגדיל את הסיכוי לאובדן נימים.

6. כביסה

1. לאחר איסוף הנימים, צנטריפוגה את כל הדגימות ב 1,500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C (רוטור דלי מתנדנד). מוציאים את הסופרנאטנט ומשעיפים מחדש את הגלולה בכ-3 מ"ל של חיץ בידוד. ערבבו את כל הכדוריות המושעות מדגימה אחת בצינור חרוטי של 15 מ"ל ומלאו אותו בחיץ בידוד. צנטריפוגה שוב ב 1,500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ו לשטוף פעמיים נוספות.
2. תעד את טוהר הנימים במיקרוסקופ (הגדלה של 100X) ובמצלמה (איור 1B).
   הערה: תשואת נימי המוח מ -10 גרם של רקמת מוח אנושית היא בדרך כלל כ -100 מ"ג. נימי המוח המבודדים יכולים כעת לשמש לניסויים, מעובדים (למשל, ליזט, בידוד ממברנה), או להיות מוקפאים במהירות הבזק ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות קריו-צינור למשך מינימום של 6-12 חודשים (הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים).

קווים	זמן
1–25	7–7.5
26–50	5–5.5
51–75	5–5.5
76–100	5–5.5
סה"כ זמן:	22–24 דקות

טבלה 1: פרוטוקול הומוגניזציה. פרוטוקול ההומוגניזציה של מטחנת הרקמה Potter-Elvehjem להומוגניזציה של 10 גרם של קליפת המוח הקדמית האנושית במהירות הומוגניזציה של 50 סל"ד. שים לב כי השבץ הראשון דורשים זמן נוסף כדי הומוגניזציה של הרקמה הטחונה. לאחר הומוגניזציה ראשונית זו, משך כל שבץ הוא 12 שניות (6 שניות לתנועה כלפי מטה, 6 שניות לתנועה כלפי מעלה). לכן, לאחר הומוגניזציה ראשונית, 5 שבץ ניתן להשיג 1 דקות, או 25 שבץ ב 5 דקות.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה לבידוד נימי. (A) הפיקטוגרמה מדגימה שלבים עיקריים של ההליך לבידוד נימי מוח מרקמה אנושית טרייה. (B) התמונה מראה נימי מוח אנושיים מבודדים תחת מיקרוסקופ אור מיד לאחר הבידוד (הגדלה של פי 100).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד מגן אישי (PPE)
Diamond Grip Plus כפפות לטקס, Microflex בינוני	VWR, Radnor, PA, ארה"ב (ארצות הברית)	32916-636	פי.פי.איי
מעילי מעבדה חד פעמיים להגנה	VWR, Radnor, PA, ארה"ב (ארצות הברית)	470146-214	PPE; בשל אופיו של חומר המקור האנושי, מומלץ להשתמש במעיל מעבדה חד פעמי
מגן פנים, חד פעמי	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	19460102	PPE; בשל אופיו של חומר המקור האנושי, מומלץ להשתמש במגן פנים חד פעמי
חומרי בטיחות
Clavies שקיות Autoclave בטמפרטורה גבוהה 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	01-815-6
נייר ספסל יבש Versi בגודל 18 אינץ' x 20 אינץ'	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	14-206-32	כדי לכסות אזורי עבודה
מערכות קונטיינרים VWR Sharps	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	75800-272	עבור אזמלים משומשים
אקונומיקה 8.2% Clorox Germicidal 64 אונקיות	מרכז אספקה בריטי, לקסינגטון, קנטקי, ארה"ב (ארצות הברית)	323775
ציוד
מקרר 4°C	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	13-986-148
מד חומציות AB15 בסיסי	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	AB15
בקרת Heidolph RZR 2102	היידולף, אלק גרוב וילג', אילינוי, ארה"ב	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR צנטריפוגה	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	75004521
מיקרוסקופ ניתוח Leica L2	Leica Microsystems Inc, באפלו גרוב, אילינוי, ארה"ב		משמש להסרת קרומי המוח
POLYTRON PT2500 הומוגנייזר	Kinematica AG, לוצרן, שוויץ	9158168
קנה מידה P-403	דנבר אינסטרומנט, בוהמיה, ניו יורק, ארה"ב (ארצות הברית)	191392
חדר סטנדרט מיני לערבב	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	1151050
Thermo-Flasks דיואר חנקן נוזלי	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, ארה"ב (ארצות הברית)	11-670-4ג	משמש להקפאת הרקמה
וויאג'ר פרו איזון אנליטי	OHAUS, פרסיפני, ניו ג'רזי, ארה"ב (ארצות הברית)	VP214CN
מיקרוקופה אקסיובטית ZEISS	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, ארה"ב (ארצות הברית)		משמש לבדיקת נימים מבודדים
כלים וכלי זכוכית
פינפיפטה II פיפטה 1-5 מ"ל	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	21377823T1	יש לשטוף נימים מהמסנן
פינפיפט II פיפטה 100-1,000 מיקרוליטר	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	21377821T1	גלולת השעיה מחדש ב- BSA
פיפט בוי	אינטגרה, הדסון, ניו המפשייר, ארה"ב (ארצות הברית)	739658
50 מ"ל צינורות פלקון 25/ארון תקשורת - 500/cs	VWR, Radnor, PA, ארה"ב (ארצות הברית)	21008-951
EISCO אזמל להבים	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	S95938C	לטחון רקמת מוח
פארפילם	VWR, Radnor, PA, ארה"ב (ארצות הברית)	52858-000	לכיסוי ובקבוק נפחי
Thermo Scientific Finntip Pipet טיפים 5 מ"ל	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	21-377-304	כדי לשטוף נימים מהמסנן
מזרק 60 מ"ל עם Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב (ארצות הברית)	BD309653	משמש עם טבעת מחבר לסינון נימים
ידית אזמל #4	Fine Science Tools, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	10060-13	משמש לטחינה
Dumont מלקחיים #5	Fine Science Tools, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	11251-10	משמש להסרת קרומי המוח
מטחנת רקמות Potter-Elvehjem	תומאס סיינטיפיק, סווידסבורו, ניו ג'רזי, ארה"ב	3.43E+28	50 מ"ל נפח, חיסול: 150-230 מיקרומטר
להקפיץ הומוגנייזר	VWR, Radnor PA ארה"ב	62400-642	15 מ"ל נפח, חיסול: 80-130 מיקרומטר
מסננים ארוגים Spectra/Mesh (300 מיקרומטר)	Spectrum Laboratories, ראנצ'ו דומינגז, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	146424	משמש לסינון תרחיף נימי כדי להסיר את כל קרומי המוח שעלולים להישאר
pluriStrainers (גודל נקבוביות: 30 מיקרומטר)	pluriSelect Life Science, לייפציג, גרמניה	43-50030-03
טבעת מחבר	pluriSelect Life Science, לייפציג, גרמניה	41-50000-03	שימוש חוזר במספר פעמים
1 ליטר בקבוק נפח			להכנת חיץ בידוד
1 ליטר			להכנת 1% BSA
סטיר בר			להכנת 1% BSA ופיקול®
בקבוק שוט (60 מ"ל)			להכנת פיקול®
דלי קרח			כדי לשמור על הכל קר
צלחת פטרי 100 מ"מ			לטחינה של רקמת המוח
מגרד תאי תרבית רקמות	VWR, Radnor, PA, ארה"ב (ארצות הברית)	89260-222	כדי להסיר supernatant לאחר צנטריפוגה
כימיקלים
BSA חלק V, A-9647	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	A9647-500 גרם	הכינו ב-DPBS עם Ca2+ ו-Mg2+ יום קודם. הימנעו מבועות במהלך ההכנה. מאחסנים במקרר. ערבבו באיטיות במשך 10 דקות לפני השימוש.
DPBS עם Ca2+ & Mg2+	היקלון	SH30264.FS	DPBS - חלק ממאגר הבידוד
פיקול PM400	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	F4375	מדידה מדויקת חשובה כאן. שוקלים בבקבוק עם מוט ערבוב. נער במרץ לאחר הוספת DPBS. שומרים במקרר O/N. יהיה בהיר בבוקר. יש לערבב בעדינות במשך 10-15 דקות לפני השימוש. יש לשמור על קרח עד לשימוש.
גלוקוז (D-(+) דקסטרוז)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	G7528	גלוקוז (D-(+) דקסטרוז) ריכוז: 5 mM
נתרן הידרוקסיד תמיסה סטנדרטית	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	71474	כדי להתאים את רמת החומציות של DPBS
נתרן פירובט	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	עמ' 2256	ריכוז: 1 mM