Zymography פפטיד פלואורסצנטי: טכניקה שונה לזיהוי פעילות פרוטאז באמצעות מצעים פלואורוגניים בג'ל זימוגרפיה

תקציר

מקור: Deshmukh, A. A. et al. זיהוי פעילות פרוטאז על ידי זימוגרפיה פלואורסצנטית של פפטידים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מבצעים זימוגרפיה, טכניקה אלקטרופורטית, כדי לנתח את הפעילות הפרוטאוליטית בתוך דגימות ביולוגיות.

פרוטוקול

1. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בג'ל זימוגרפיה פפטידי

1. יש להמיס דגימות במאגר דגימות זימוגרפיה קונבנציונלי (62.5 מילימטר Tris-HCl, pH 6.8, 25% גליצרול, 4% SDS, 0.01% ברומופנול כחול). עבור דגימות תאים ורקמות, ~ 30 מיקרוגרם של חלבון כולל לכל באר מומלץ, ו 50-100 ng של חלבון עבור תקני MMP.
2. הוסף 400 מ"ל של 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer למנגנון הג'ל. לטעון עד 35 μL של מדגם לכל באר. הפעל את הדגימות ב 120 V ב 4 ° C במשך 1.5 שעות או עד תקני המשקל המולקולרי מצביעים על כך שהפרוטאזות המעניינות נמצאות בתוך שכבת הג'ל לפתרון פפטיד (שיש לה צבע כתום גלוי).
   הערה: רוב MMPs ואת הגרסאות שלהם נופלים בטווח של 35-100 kDa. כאשר תקני המשקל המולקולרי מצביעים על כך שמשקלים אלה נמצאים בתוך שכבת הג'ל לפירוק פפטידים, ניתן לעצור אלקטרופורזה. אותו עיקרון יכול להיות מיושם על סוגים אחרים של פרוטאזות עם משקלים מולקולריים ידועים. אם יש עניין בגילוי פרוטאזות מרובות על פני טווח גדול יותר של משקלים מולקולריים, הקטינו את גודל שכבת הג'ל המפענח והגדילו את שכבת הג'ל הממיס פפטידים.
3. לאחר אלקטרופורזה, יש להסיר את הג'לים מקסטת הפלסטיק ולשטוף את הג'ל שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה במאגר רנטורינג המכיל 2.5% Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ ו-5 mM CaCl₂ ב-50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
4. העבירו את הג'לים לתמיסת חיץ מתפתחת המכילה 1% Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ ו-5 mM CaCl₂ in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 למשך 15 דקות. יש להחליף בתמיסת חיץ טרייה ומתפתחת ולדגור על ג'לים בטמפרטורה של 37°C תחת תסיסה עדינה למשך 24 שעות, תוך הקפדה על שקוע מלא בתמיסה.
5. לאחר 24 שעות, יש להשתמש בג'ל פלואורסצנטי באמצעות סורק/מכונת הדמיה של ג'ל פלואורסצנטי באמצעות מסנני העירור והפליטה המתאימים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קסטות ג'ל ריקות 1.5 מ"מ	תרמופישר סיינטיפיק	NC2015
פתרון SDS 20%	אמביון	AM9820
3x מאגר דוגמת זימוגרפיה	ביו-ראד	1610764
ערכת Azido-PEG3-Maleimide	לחץ על כלי כימיה	AZ107
ספק כוח בסיסי PowerPac	ביו-ראד	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	ביו-ראד	161-0374
PrecisionGlide מחטים היפודרמיות	פישר סיינטיפיק	14-826