מיקוד מבוסס אולטרסאונד מיקרו-בועות בתיווך מחסום דם-מוח: טכניקה ליצירת פתחים ארעיים מקומיים במחסום דם-מוח של עכבר על ידי סונופורציה

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. מערכת אולטרסאונד ממוקדת

הערה: ההתקנה המתוארת היא מערכת שיבוש BBB בנויה פנימית המבוססת על רכיבים הזמינים מסחרית וכוללת חרוט מותאם אישית המודפס בתלת-ממד ופלטפורמה סטריאוטקטית ניתקת. המערכת מתוכננת מודולרית, המאפשרת שינויים בהתאם לציוד הזמין ולשימוש ספציפי. הפרוטוקול מתאר את הליך הסונופורציה של אזור גדול יותר באזור הפונטיני של מוח העכבר. על-ידי התאמת מיקום המטרה, אזורים שונים במוח יכולים להיות ממוקדים. במחקר זה, נעשה שימוש במתמר מונו-אלמנט 1 MHz עם אורך מוקד של 75 מ"מ, צמצם של 60 מ"מ, ואזור מוקד של 1.5 x 1.5 x 5 מ"מ (FWHM של לחץ שיא). מישור המוקד של המתמר ממוקם דרך הגולגולת של בעל החיים במישור האופקי המצטלב עם מוטות האוזן.

1. בחר מתמר מתאים לפתיחת BBB במכרסמים.
   הערה: בהתבסס על תכונות המיקרו-בועות והתדר המועסק, ההגדרות האקוסטיות, במיוחד האינדקס המכני (MI), כפופות לשינויים.
2. מניחים את המתמר בחרוט המודפס בתלת-ממד.
3. השתמש בקרום מיילרי שקוף אקוסטית בקצה התחתון של החרוט כדי להשיג צימוד אקוסטי של נתיב התפשטות הקרן, ומלא את החרוט במים ששוחררו מגז.
4. הרכיבו את המתמר מעל החיה על במה ליניארית ממונעת כפי שמוצג באיור 1, מה שמאפשר מיקום אנכי אוטומטי של המתמר.
5. תכננו פלטפורמה סטריאוטקטית ניתנת להסרה בהתבסס על דרישות המחקר, הכוללת חימום מווסת טמפרטורה, מוטות נשיכה ואוזניים, הרדמה וסמנים רב-מודאליים, כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2. הרכבת הפלטפורמה הסטריאוטקטית מורכבת ממערכת במה ליניארית דו-ממדית, המאפשרת מיקום אוטומטי מדויק (< 0.1 מ"מ) של החיה מתחת לקרן.
6. חברו את המתמר לשרשרת הפליטה האקוסטית המוצגת באיור 1, המורכבת ממתמר, מחולל פונקציות ומגבר הספק.
7. תכנן צינור עיבוד תמונה כדי לזהות את הסמנים הפידוקיאליים הרב-מודאליים המאפשרים מיקוד סונופורציה מדויק של אזור העניין במוח ואיסוף נתוני הקוויטציה שזוהו על ידי הידרופון המחט.
8. כיול המערכת וקביעת נקודת המיקוד של המתמר בהתאמה למיקום אנכי של החיה על הפלטפורמה הסטריאוטקטית.

2. הכנת בעלי חיים

הערה: הפרוטוקול הבא מצוין עבור עכברים, אך ניתן להתאים אותו לחולדות. לצורך ניסויים אלה נעשה שימוש בעכברים בעירום אתימי נקבי Foxn1-/- (בני 6-8 שבועות).

1. לאפשר לבעל החיים להתאקלם לפחות שבוע במתקן בעלי החיים ולשקול את בעל החיים באופן קבוע.
2. מתן buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה תת עורית (s.c.) 30 דקות לפני טיפול FUS כדי להתחיל טיפול משכך כאבים.
3. יש להרדים את בעל החיים עם 3% איזופלורן, 2 ליטר/דקה O₂ ולוודא שבעל החיים מורדם עמוק. שמור על בעלי החיים מורדמים במהלך כל ההליך ולפקח על תדירות הנשימה וקצב הלב כדי להתאים את ריכוז isoflurane לפי הצורך.
4. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים ולמנוע פגיעה אפשרית.
5. יש להסיר את השיער בחלק העליון של הראש עם סכין גילוח וקרם מסיר שיער ולשטוף לאחר מכן במים כדי להסיר שאריות כדי למנוע גירוי לעור.
6. לניסויים עם מודלים של גידולי BLI, הזריקו 150 μL של D-luciferin (30 מ"ג/מ"ל) intraperitoneal (כלומר) עם מזרק אינסולין 29G להנחיית תמונת BLI.
7. הכנס צנתר ורידי זנב 26-30G ושטוף את הצנתר והווריד בנפח קטן של תמיסת הפרין (5 UI/mL). מלא את הצנתר בתמיסת הפרין כדי למנוע קרישת דם.
   הערה: צנתור טוב נראה כאשר יש ריפלוקס של דם לתוך הצנתר. הימנעו מבועות אוויר בצנתר כדי למנוע אמבולי. כדי להימנע מלחץ הזרקה מוגזם, יש לוודא שאורך הצנתר קצר ככל האפשר.
8. הניחו את בעל החיים על פלטפורמה סטריאוטקטית מווסתת טמפרטורה כדי למנוע היפותרמיה.
   הערה: היפותרמיה מפחיתה את זרימת הדם, אשר יכולה להשפיע על הזרקת/מחזור של מיקרו-בועות ועל הפרמקוקינטיקה של התרופות.
9. לשתק ולקבע את ראש החיה על הפלטפורמה הסטריאוטקטית באמצעות מוטות אוזניים ומוט נשיכה. מקבעים את הגוף עם רצועה ומדביקים את זנב החיה לפלטפורמה.

3. In Vivo Image-guided Focused Ultrasound

הערה: עבור פרוטוקול זה נעשה שימוש במתמר מונו-אלמנט של 1 MHz עם פולס פרץ טון עם משך של 10 אלפיות השנייה, MI של 0.4 ותדירות חזרה על פולס של 1.6 הרץ עם 40 מחזורים במשך 240 שניות. הפרוטוקול מותאם למיקרו-בועות המיוצבות על ידי פוספוליפידים המכילים הקספלואוריד גופריתי (SF₆) כגז בלתי מזיק, כאשר קוטר הבועות הממוצע הוא 2.5 מיקרומטר ויותר מ-90% מהבועות קטנות מ-8 מיקרומטר.

1. מקם את הפלטפורמה הסטריאוטקטית עם בעל החיים הרכוב במודאליות ההדמיה (למשל, BLI או רנטגן) וצלם תמונות של החיה.
2. השתמש בסמנים הפידוקיאליים הרב-מודאליים בשילוב עם צינור עיבוד התמונה כדי לסמן את מיקום החיה בהתאם לנקודת המיקוד של המתמר.
3. קבעו את אזור המטרה על-ידי הצבת קווי מתאר במוח מעל תמונת הרנטגן שנרכשה או שימוש בתמונות BLI כדי לקבוע את מרכז הגידול (איור 2). המיקום של אזורים מסוימים במוח מצוין באטלס המוח של פקסינוס באמצעות סימוני הגולגולת bregma ו-lambda כנקודות ייחוס. לדוגמה, הפונס ממוקם x=-1.0, y=-0.8 ו-z=-4.5 מלמדא.
4. הגן על הנחיריים והפה של בעל החיים עם סרט הדבקה כדי למנוע מג'ל אולטרסאונד להפריע לנשימה.
5. יש למרוח ג'ל אולטרסאונד על ראשה של החיה.
6. משכו את עור צווארם של בעלי החיים, סיככו את הידרופון המחט בג'ל אולטרסאונד והניחו את הידרופון המחט בסביבה הישירה של עצם העורף.
7. כוון את המתמר למיקום הנכון באמצעות צינור עיבוד התמונה ונקודת המיקוד.
8. החל את ההגדרות המוגדרות מראש על כל המכשירים המחוברים והתמקד באזור המוח המעניין.
   הערה: בהתאם לשאלת המחקר, גידולים או אזורי מוח יכולים להיות סונופורציה כנקודת מוקד יחידה או כצורה נפחית, כפי שמוצג באיור 2.
9. הפעל מיקרו-בועות כמתואר על-ידי היצרן. הזריקו בולוס אחד של 120 μL (5.4 מיקרוגרם) של מיקרו-בועות.
10. שטפו את צנתר ורידי הזנב במי מלח כדי לבדוק את פתיחת הצנתר.
11. הזריקו את המיקרו-בועות והתחילו את התהודה.
12. הקלט קוויטציה של מיקרו-בועות עם הידרופון המחט.
13. מתן חומר ניגוד תוך וסקולרי או תרופה לאחר סונופורציה. המינון, העיתוי והתכנון תלויים במטרת המחקר ובתרופה.
    הערה: כחול אוונס הוא סוכן צבע נפוץ להערכת פתיחת BBB.
14. עקוב אחר בעל החיים עד לנקודת הזמן שנקבעה מראש או לפני נקודת הסיום ההומאנית.

איור 1: הגדרת אולטרסאונד ממוקד. (A) ייצוג סכמטי של מערך האולטרסאונד הממוקד. (B) תמונה של מערך האולטרסאונד הממוקד. המערכת מורכבת ממתמר המותקן מלמעלה למטה על במה ליניארית 1D מעל שלב דו-ממדי שני למיקום תלת-ממדי אוטומטי. המתמר בנוי בחרוט קרן מלא מים, סגור בתחתית עם קרום מיילרי שקוף אקוסטית, המוליך את הצליל לגולגולת החיה. המתמר מחובר למגבר כוח, אשר בתורו מחובר למחולל צורת גל שרירותי (AWG) ליצירת אותות. לגילוי קוויטציה נעשה שימוש בהידרופון ניתק בשילוב עם מגבר מתח רעש נמוך. ההידרופון ממוקם בסביבה הישירה של עצם העורף. להידרופון החיצוני משטח פעיל של 2 מ"מ והוא משולב אקוסטית עם ג'ל אולטרסאונד. הן אות המתח הגבוה של פולס העירור והן אות הקוויטציה המוקלט עוברים דיגיטציה באמצעות אוסצילוסקופ סטנדרטי של 200 מגה-הרץ ומועברים למחשב בקרה (לא מוצג) לצורך עיבוד מהיר ובקרה בזמן אמת.

איור 2: זרימת עבודה ממוקדת באולטרסאונד. זרימת העבודה המוצעת של מערכת האולטרסאונד הממוקדת מתחילה עם (א) המיקום הראשוני של בעל החיים על פלטפורמה סטריאוטקטית ניתקת, שימו לב ליישום ג'ל הצימוד האקוסטי (מוחל לאחר BLI / רנטגן). בו זמנית ניתן לבצע הדמיה מולטימודאלית למיקוד. (B) בתחילה, הדמיית רנטגן היא אפשרות, בעוד שאזור עניין יכול להיות ממוקד בעזרת מתאר של המוח (שבתורו מופנה לאטלס מוחהעכבר 40, המותאם לגודל וליציבה של הגולגולת). (C) לחלופין, ניתן ליישם תמונת BLI של גידול גליומה מפוזר בקו האמצע של לוציפראז על הקרנה בעוצמה מרבית של קרני רנטגן לצורך מיקוד. (D) לאחר מכן, הפלטפורמה הסטריאוטקטית מותקנת כאשר בעל החיים במצב טיפול עם הידרופון ומתמר מחוברים. המתמר מניע באופן אוטומטי בתנוחת טיפול ומסניק את המסלול שנבחר לאחר הזרקת בולוס. המערכת מותאמת לניסויים בתפוקה גבוהה, כאשר פלטפורמות מרובות מאפשרות עבודה משולבת, כפי שמוצג למעלה.