In utero Electroporation Based Gene Delivery: טכניקה להזרקת DNA פלסמיד לתאי המוח הקטן העובריים של עוברי מורין

תקציר

מקור: Feng W. et al. ניתוח אובדן תפקוד בתיווך CRISPR בתאי גרגיר המוח הקטן באמצעות העברת גנים מבוססת אלקטרופורציה ברחם. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את העברת הדנ"א של פלסמיד לתאי עצב צרבלריים של עוברי מורין באמצעות אלקטרופורציה ברחם. שיטה זו שימושית כדי להשיג הבנה של תפקוד in vivo של גנים בהתפתחות מוחית תקינה והשינויים בביטוי גנים של תאי נוירון במהלך התקדמות הגידול.

פרוטוקול

1. בצע אלקטרופורציה ברחם

1. הרבו עכברים בני 6 עד 8 שבועות והכינו את הכלים להתחשמלות ברחם. לחצות עכברים הומוזיגוטים הומוזיגוטיים Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP עם נקבות עכברים CD-1. הזמן את ההריון של עכברות CD-1 מיום גילוי פקק הנרתיק (E0.5). עוברים מתחשמלים ביום E13.5.
   1. משוך נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר פנימי: 0.6-0.8 מ"מ) עם מושך מיקרופיפטה. השתמש בהגדרות הבאות: P = 500, חום = 560, משיכה = 150, Vel = 75, זמן = 250. תייג את קצה הנימים בדיו שחור להדמיה טובה יותר במהלך ההזרקה. חותכים את הטייפר הנימי תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות סרגל ופינצטה מחט חדה וחותכים את הקצה באורך של כ-6 מ"מ.
   2. שמור על אחדות הנימים כדי לשמור על הניסוי ניתן לשחזור. צרו קצה משופע חד-צדדי במהלך החיתוך. הקצה צריך להיות חד ככל האפשר לחדירה קלה של דופן הרחם וכדי למנוע נזק לרקמות של העובר.
      הערה: לחלופין, השתמש במטחנת מיקרו כדי להתאים זווית של 35°. את הנימים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ בתנאים נטולי פתוגנים.
   3. Autoclave את כלי הניתוח.
   4. ערבבו את פלסמידים sgRNA בחלקים שווים עם pT2K-IRES-Luc לריכוז סופי של לפחות 1 מיקרוגרם/μL עבור כל פלסמיד וצבעו את תמיסת הפלסמיד בירוק מהיר (ריכוז סופי של 0.05%). הכינו תמיסת מלאי ירוק 1% מהירה עם מים מזוקקים ללא אנדוטוקסין וסננו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקי צבע מהתמיסה.
      הערה: העברה משותפת של pT2K IRES-Luc היא אופציונלית, אך מאפשרת זיהוי של בעלי חיים מחושמלים בני קיימא לאחר הלידה באמצעות הדמיית ביולומינסנציה. הכן כמות מספקת של פלסמיד תערובת עבור המספר הכולל של עכברות בהריון להיות מנותח. השתמש בערך 15-20 μL תערובת לכל עכבר (~ 12 עוברים). המשך מיד עם הניתוח.
2. הכנת עכברים לניתוח
   1. להרדים עכברי CD-1 בהריון עם איזופלורן. יש להשרות הרדמה בקופסה עם איזופלורן 3-4% וול-% (קצב זרימת חמצן: 1.5 ליטר/דקה) ולשמור עליה עם 2 כרכים-% במהלך הניתוח דרך חרוט האף.
      הערה: הניתוח המלא לא אמור להימשך יותר מ -30 דקות. להפחית את מספר העוברים המוזרקים והמחושמלים, במידת הצורך. השתמש בכפפות סטריליות לניתוח.
   2. הניחו את העכבר על גבו על כרית חימום וכווננו את חומר ההרדמה.
   3. הזרקת משכך כאבים (Metamizol, 800 מ"ג/ק"ג משקל גוף, תת עורית (s.c.), 24 שעות מחסן).
      הערה: אתה יכול להשתמש משככי כאבים מורשים אחרים מאשר Metamizol.
   4. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח.
   5. לתקן איברים עם סרט לעקר את הבטן עם חומר חיטוי. מכסים את העכבר בגזה, ומשאירים רק את אזור הניתוח חשוף. לפזר 70% אתנול על אזור כירורגי גזה.
   6. יש לבצע חתך עור באורך של כ-2 ס"מ ולהרחיב את הרווח בעדינות בעזרת מספריים כירורגיים ישרים. אתר את linea alba ובצע חתך שני מעט קטן יותר דרך הצפק באמצעות מספריים רקמה עם קצה קהה.
   7. יש להרטיב את חלל הבטן הפתוח בעזרת 1x PBS סטרילי שחומם מראש.
   8. בזהירות לחלץ את קרני הרחם מחלל הבטן באמצעות מלקחיים טבעת. משוך בעדינות על ידי תפיסת דופן הרחם אך ורק ברווח שבין שקי החלמון של שני עוברים שכנים. הימנע מכל לחץ על העובר בעת משיכתו דרך החתך. הגדילו את החתך במידת הצורך והקפידו במיוחד למקם את קרני הרחם על הבטן מבלי לדחוס את זרימת הדם בעורק הרחם.
      הערה: במקרים מסוימים, מומלץ לחלץ קרן רחם אחת בכל פעם ולהחליף אותה לפני שתמשיך עם קרן הרחם השנייה.
3. הזרקה ואלקטרופורציה של DNA פלסמיד
   1. שאפו כ -15 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד צבעונית עם נימי הזכוכית המוכנים. הימנע מבועות אוויר במהלך תהליך זה.
      הערה: תמיסת הפלסמיד יכולה לסתום את הקצה בקלות אם ריכוזו גבוה. בדוק את הנימים על ידי שחרור קצת DNA ממש לפני ההזרקה.
   2. החזיקו את העובר בעדינות עם מלקחיים טבעתיים ואתרו את אזור הצוואר.
      הערה: אם העובר נמצא בתנוחה קשה להזרקה, דלגו עליו ולכו על העובר הבא. מיקום מחדש מוגבר של העובר עלול להגדיל את הסיכויים לנזק להם.
   3. חודרים באיטיות עם קצה נימי הזכוכית שהוכנו בעבר לחדר הרביעי על ידי חדירה דרך המוח האחורי הגבי ולאחר מכן מזריקים כ -1 מיקרוליטר של תערובת הפלסמיד. ודא שהדנ"א הצבוע אינו דולף מהמוח ונראה כמבנה בצורת יהלום.
      הערה: כאופציה, השתמש במשקפיים מגדלות פי 2.5 להדמיה טובה יותר של החדר הרביעי וכלי הדם שמסביב. יש להעביר פולסים חשמליים מיד לאחר ההזרקה כדי למנוע דיפוזיה של תמיסת הפלסמיד לחדרים האחרים.
   4. החל פולסים מרובעים חשמליים (5 פולסים, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) עם פינצטה פלטינה דמוית מלקחיים (ראה טבלת חומרים). הניחו את האלקטרודות לרוחב כאשר הקוטב השלילי מכסה את האוזן והקוטב החיובי ממוקם בפרימורדיום המוח הקטן מעל דופן הרחם. השתמש לוחות אלקטרודה בקוטר 5 מ"מ לאלקטרופורציה יעילה של עוברי E13.5.
      הערה: הגדל את שיעור ההישרדות של גורים על ידי מניפולציה של פחות מ -2/3^rd ממספר העוברים הכולל לכל סכר. הימנעו מעוברים קרובים מדי לצוואר הרחם. אם הם עוברים מניפולציה, הם עלולים לגרום לסיבוכים במהלך הלידה ולסכן את ההמלטה כולה. אם אלקטרודות קרובות מדי ללב העובר, הדבר עלול לגרום לדום לב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
להקת Autoclave	קיסקר ביוטק	150262
אלקטרו סקוור פורטור	BTX	ECM830
ערכת מקסי אנדופרי	קיאגן	12362
אתנול	מרק	107017
משחת עיניים (Bepanthen)	באייר	81552983
ירוק מהיר	מרק	104022
מסנן (0.22 מיקרומטר)	מרק	F8148
מלקחיים ישר	כלים מדעיים משובחים	91150-20
גזה (X100 ES-pads 8f 10 x 10 ס"מ)	פישר סיינטיפיק	15387311
נימי זכוכית עם נימה	נארישיגה	GD1-2
כרית חימום	תרמולוקס	463265 / -67
איזופלורן	זואטיס	TU061219
טבעת מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11103-09
סטריאומיקרוסקופ	ניקון	C-PS
מספריים כירורגיים	כלים מדעיים משובחים	91460-11
מספריים כירורגיים עם קצה קהה	כלים מדעיים משובחים	14072-10
פינצטה עם אלקטרודות דיסק 5 מ"מ פלטינום	Xceltis GmbH	CUY650P5
מטמיזול	WDT
חוט תפר משי לא סטרילי (0.12 מ"מ)	כלים מדעיים משובחים	18020-50
PBS (1x)	לייף טכנולוגיות	14190169
מספריים רקמה קהה (11.5 ס"מ)	כלים מדעיים משובחים	14072-10
pCAG-EGxxFP	אדג'ין	50716
פלסמיד pX330	אדג'ין	42230