מודל הפלישה הפרי-עצבית של מורין: יצירת מודל In Vivo להדמיית פלישה פרי-עצבית בעצב הסיאטי של עכבר

תקציר

מקור: Deborde, S. et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מפתחים מודל עכבר in vivo לפלישה פריעצבית על ידי הזרקת תאי סרטן הלבלב לעצב הסיאטי. מודל זה מסייע לכמת את היקף הפלישה ולחקור את יחסי הגומלין בין תאים סרטניים ועצבים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת העכברים והניתוח

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בני 8 שבועות, זכר ונקבה. תנאי הניתוח תואמים את כללי IACUC של המוסד שלנו. המכשירים מעוקרים, משטח העבודה הכירורגי מחוטא, בעל החיים מחוטא והמנתח לובש כפפות סטריליות.

1. ביום שלפני הניתוח, יש להרדים את העכבר באמצעות איזופלורן 2% ולאחר מכן להסיר את הפרווה לאורך עצם הירך בצד הגבי בעזרת סכין גילוח דקה או חומר כימי להסרת שיער.
2. ביום הניתוח מרדימים את העכברים באמצעות איזופלואורן 2% בתא זירוז. לאשר את ההרדמה על ידי גירוי צביטת בוהן וחוסר תגובה.
3. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בהרדמה.
4. הניחו את העכבר המרדים על צדו הגחוני, ואבטחו בעדינות כל איבר באמצעות סרט היפואלרגני כדי ליצור מתח קל באיבר המוזרק. ההרדמה נשמרת באמצעות איזופלורן המועבר באמצעות וופורייזר מדויק וחרוט אף.
5. נקו את אזור ההזרקה עם בטדין, ואז שוב עם 70% אלכוהול. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות. יש לוודא כי לא נשאר שיער רפוי בשדה הניתוח.
6. בצע חתך של 1 ס"מ עם מספריים קטנים כ -2 מ"מ מתחת ובמקביל לעצם הירך. משכו את העור עם מלקחיים לרוחב כדי לחשוף את השרירים שמתחת.
7. העצב הסיאטי זורם עמוק אל שרירי הגלוטאוס מקסימוס ושרירי הירך הדו-ראשיים. הפרידו את שני השרירים הללו לאורך מישור פשיאלי בעזרת מספריים קטנים וחשפו את העצב הסיאטי שמתחתיו. שחררו את העצב מהשרירים הסובבים אותו באמצעות דיסקציה קהה.
8. צייר 3 μL של תאים סרטניים (כ -50,000 תאים) מן הגלולה לתוך מזרק 10 μL.
   הערה: לחלופין, צייר 3 μL של PBS כבקרה.
9. הניחו מרית מתכת קטנה מתחת לעצב בנקודת ההזרקה לתמיכה. תחת הדמיה עם מיקרוסקופ ניתוח, להחדיר את המחט לתוך העצב כנגד בסיס המתכת, שמירה על המחט מקביל לעצב ככל האפשר עם החדרה. היזהר לא לנקב דרך החלק האחורי של העצב. למזער את הטיפול של עצב ככל האפשר לאורך תהליך זה.
10. להזריק לאט לתוך העצב מעל 5 שניות. היווצרות של נורה באזור ההזרקה מעידה על הזרקה טובה. לאחר מכן השאירו את המחט במקומה למשך 3 שניות לפני שתוציאו את המחט בעדינות. שמירה על המחט במקומה למשך 3 שניות ממזערת את הזרימה חזרה של התאים אל מחוץ לעצב.
    הערה: הזרקה יכולה להתבצע לכיוון העצב הדיסטלי או חוט השדרה. חשוב להישאר עקביים בתוך סדרה של ניסויים. אם התאים נשפכים החוצה, אין לכלול את החיה בניתוח הניסוי. עם ניסיון, אירועים אלה נדירים מאוד.
11. להחזיר את העצב למקומו המקורי. כסו את העצב עם השרירים שמעליו. לטפל בעכברים עם שיכוך כאבים מתאים, ולאחר מכן לסגור את העור עם 5-0 תפרים ניילון.
12. הניחו את העכבר לבדו בכלוב נקי להשגחה במהלך ההתאוששות, עד שיתעורר לחלוטין מההרדמה.
    הערה: לוקח 5-15 דקות עד שבעל החיים חוזר להכרה מלאה. בעל החיים אינו נשאר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. בעל החיים אינו מוחזר לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. לאחר מכן, להעריך התאוששות לפחות פעם אחת כל 24 שעות במשך 72 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכבר			משתנה מספר וגיל בהתאם לצרכי הניסוי
סכין גילוח חשמלי	וואהל	9962	ניתן להחליף בחומר מסחרי להסרת שיער
איזופלורן, 250 מ"ל	בקסטר	1001936060
סרט כירורגי היפואלרגני	3M בלנדרם	70200419342
מקלות החלפה של בטאדין	PDI	מק"ט: 41350
Webcol אלכוהול מכין	קובידיאן	5110
כלי ניתוח סטריליים (מספריים ומלקחיים)
מזרק המילטון 10 μL	המילטון	80308
פלדה מיקרו מרית	פישר סיינטיפיק	S50823
מיקרוסקופ מנתח
Bupivacine, 1 גרם	אנצו מדעי החיים	BML-NA139-0001	להרכיב מחדש עד 0.5%
תפר ניילון 5-0	אתיקון	698H