השתלה אורתוטופית ארוכת טווח של תאי גידול בעוברים של דגי זברה: שיטה יעילה להעברת תאי גידול לחדר הרביעי של עוברי דגי זברה לניתוח ארוך טווח של התנהגות תאי הגידול

תקציר

מקור: Casey, M. J. et al. השתלת גידולי מוח בילדים של דגי זברה בפונדקאים כשירים למערכת החיסון לצורך מחקר ארוך טווח של התנהגות תאי הגידול והתגובה לתרופות.J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים השתלה אורתוטופית של תאי גידול במוח של דגי זברה בחדר הרביעי של עובר דג זברה מדוכאי חיסון. הליך זה מאפשר מחקר ארוך טווח של פלישה והתנהגות של תאי גידול.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הזרקת תרחיף הגידול לחדר הרביעי של עובר 2-dpf

1. העברת 10-20 עוברים מורדמים לפריפריה של צלחת ההזרקה באמצעות פיפטת החזרה; העוברים צריכים ליפול לרוחב על צלחת ההזרקה, כאשר החדרים גלויים ונגישים בבירור. השתמש בבדיקה זוויתית כדי להתאים את העוברים לפי הצורך ולמקם אותם הרחק מהקצה החיצוני של צלחת ההזרקה.
2. יש להעמיס 1-2 μL של תרחיף תאי הגידול לתוך מחט ההזרקה באמצעות קצות פיפטה להעמסת ג'ל ולהחדיר את המחט לתוך המניפולטור.
3. הורד ידנית את המניפולטור, מחזיק את המחט בזווית של 45 מעלות. כוונן את הידיות במיקרומניפולטור בכיווני x, y ו- z עד שהמחט נמצאת ממש מעל וכ -5 מ"מ מימין לראש העובר. הסתכלו דרך העיניות של הסטריאומיקרוסקופ והתאימו לאט את המיקרומניפולטור בכיוון ה-x עד שהמחט תנקב את החדר הרביעי של העובר. אין לאפשר למחט לחדור את הלב או החלמון.
   1. לחץ על דוושת הרגל המחוברת למיקרו-מזרק כדי להזריק את מתלה תאי הגידול.
      הערה: לחץ ההזרקה והזמן ישתנו בהתאם לגודל המחט, אך נקודת התחלה טובה היא 5-10 PSI ו-50-100 מילישניות. ניתן להעריך את נפח תאי הגידול המוזרקים בטכניקות סטנדרטיות של טיפת שמן באמצעות הזרקה לשמן מינרלי, במידת הצורך. הזרקות של 500 pL עם קוטר טיפה של 0.1 מ"מ בדרך כלל לתת את התוצאות הטובות ביותר.
4. שטפו בעדינות את העוברים המוזרקים מצלחת ההזרקה לתוך צלחת פטרי באמצעות מי ביצה מתוקים (0.6 גרם / ליטר מלח אקווריום במי אוסמוזה הפוכה + 0.01 מ"ג / ליטר מתילן כחול). שמור את העוברים במי ביצים עבור ההליכים הנותרים או עד שהם גדלים במיכלים.
5. בדוק את העוברים המוזרקים תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. ודא כי לחץ ההזרקה, הזווית, גודל המחט וצמיגות תרחיף התא גורמים לכך שתאי הגידול ממלאים 25-50% מחלל החדר. התאם פרמטרים אלה לפי הצורך.
6. חזור על שלבים 1.1-1.5 עבור כל העוברים הנותרים. מרדימים את העוברים הנוספים לפי הצורך.
   הערה: משתמש מנוסה יכול להזריק עד 300 עוברים במשך 3-4 שעות.
7. החזירו את העוברים לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
8. למחרת, להעריך את הישרדות העובר על ידי בחינת מאפיינים מורפולוגיים ופיזיולוגיים, כגון התפתחות לב ומוח תקינה, כמתואר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מי ביצה	בבית		שמירה על עוברים, ביצוע צלחת הזרקה
צלחת פטרי	תרמו פישר	FB0875711Z	דיור עוברים, ביצוע צלחת הזרקה
מיכל זכוכית	כל מותג מסחרי		הכנת צלחת הזרקה
מיקרופיפטות	כל מותג מסחרי		השעיית גידול והשתלתו
בדיקה זוויתית	כלים מדעיים משובחים	10140-02	מניפולציה בעובר
העברת פיפטה	כל מותג מסחרי		מניפולציה בעובר
סטריאומיקרוסקופ	אולימפוס	SZ61	השתלת גידול
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	SZX16	הדמיה של השתלות גידולים
מצלמת מיקרוסקופ	אולימפוס	DP-72	הדמיה של השתלות גידולים
אינקובטור	כל מותג מסחרי		שמירה על עוברים, חימום צלחת הזרקה
N2	כל מותג מסחרי		להגדרת מיקרו-מזרק
נימי זכוכית (ללא חוט להט)	מכשירים מדויקים בעולם	TW120-4	השתלת גידול
מושך מחטים	סאטר אינסטרומנטס	P-97	השתלת גידול
טיפים למעמיסים זעירים	אפנדורף	930001007	השתלת גידול
מיקרו-מזרק	מכשיר הרווארד	PLI-90	השתלת גידול
טריקאין-S (MS-222)	כימיקל מערבי	TRS1	השתלת גידול, הרדמה
אגרוז	דנוויל	CA3510-8	הכנת צלחת הזרקה
מיקרוגל	כל מותג מסחרי		הכנת צלחת הזרקה
סולם	כל מותג מסחרי		הכנת צלחת הזרקה
כפפות	כל מותג מסחרי		כל היבטי הפרוטוקול
פרונאז	רוש דיאגנוסטיקה	11459643001	עוברים Dechorionate
סכין גילוח	תרמו פישר	12640	הכנת מחטים
50 מ"ל (קוטר 2 אינץ ')	כל מותג מסחרי		הכנת צלחת הזרקה
מיכל זכוכית	כל מותג מסחרי		הכנת צלחת הזרקה
מתילן כחול	סיגמא-אולדריץ'	M9140	יש להוסיף למי הביצים כדי למנוע צמיחה פטרייתית