העברה תוך אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים (NSCs) במודל מורין: הליך למסירה ממוקדת גידול של NSCs טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר נושא גידול במוח

תקציר

מקור: Yu, D. et al. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים את ההעברה התוך-אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר הנושא גידול במוח. הניהול התוך-אפי הלא פולשני של תאי גזע עוקף את מחסום הדם במוח, ומקל על העברתם לאתר הגידול במוח ליישומים טיפוליים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. התניה מוקדמת היפוקסית של תאי גזע עצביים אנושיים (איור 1A)

1. לוחות מעובדים בתרבית צלחות בצלוחיות תרבית T75 עד שמגיעים למפגש של 90%.
2. הניחו צלוחיות תרבית תאים בתוך תא/אינקובטור CO₂ לח עם רמות O₂ מתוחזקות למשך 24 שעות, באמצעות אספקת גז N₂ הנשלטת על ידי מד זרימה מובנה אוטומטי. תאים אלה מכונים ^HNSCs. Control ^NNSCs נוצרים כ:
   1. שמור על NSCs אנושיים (שיבוט HB1.F3.CD) בתווך DMEM עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור לח של 37°C מתחת ל-95% אוויר בחדר ו-5% CO₂.

2. העמסת תאי גזע עצביים אנושיים עם וירוס אונקוליטי (איור 1B-1H)

1. להדביק ^NNSCs, ^HNSCs עם 50 אדנווירוס משוכפל מותנה (CRAd)-S-pk7 חלקיקים נגיפיים / תא.
2. לאחר שעתיים של דגירה בטמפרטורת החדר עם הקשה תקופתית, יש לשטוף תאים שלוש פעמים במדיה כדי להסיר חלקיקים נגיפיים לא קשורים ולהשהות תאים במי מלח סטריליים להזרקה.
   זהירות: לבצע את כל הליכי תרבית תאי המבחנה הקשורים לווירוס במתקנים עם ייעוד רמת הבטיחות הביולוגית המתאימה, כגון BSL2. חוקרים המטפלים בנגיף האונקוליטי חייבים ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בהתאם להנחיות המוסד למתקנים לבעלי חיים.

3. העברה תוך-אפית של תאי גזע גזעיים טיפוליים (איורים 1D ואיור 2D)

1. תרבות ואיסוף NSCs (^NNSCs, ^HNSCs).
2. מרדימים עכברים באמצעות הזרקת תערובת קטמין וקסילזין בהתאם לנוהל:
   1. מרדימים את בעל החיים על בסיס משקל הגוף באמצעות ריאגנטים מאושרים, כלומר, באמצעות הזרקה תוך צפקית (i.p.) של תערובת קטמין (50-100 מ"ג/ק"ג; יש להתייעץ עם IACUC מוסדי לגבי טווח המינונים המאושר) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג; להתייעץ עם IACUC מוסדי לגבי טווח המינונים המאושר) במי מלח סטריליים של 200-250 מיקרוליטר, או באמצעות הרדמה איזופלורנית 4-5% באמצעות מכשיר אינהלציוני.
3. הניחו עכברים על וילון נקי הפונה כלפי מעלה עם כרית חימום מתחתיו כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. התאימו כרית מרופדת העשויה ממגבות נייר מגולגלות בעזרת סרטים כדי להבטיח את הזווית הזקופה של הנחיריים כאשר הם מונחים מתחת לראש העכבר.
4. באמצעות מיקרופיפטה, לחלק 2 μL של מתלה NSC לכל נחיר של העכבר. לאשר חזותית את השאיפה של הטיפה לפני המעבר לעכבר הבא. המשתמש יכול לקבוע את המספר הכולל של התאים שנמסרו; להשתמש 62,500-125,000 תאים/μL, כך 0.5-1 מיליון תאים יכולים להיות מועברים במנות 4 x 2 μL.
5. השתמש בטיימר כדי להבטיח מרווחים של 5 דקות בין כל ניהול השעיה של התא, עד 4 פעמים.
6. אפשרו לבעלי חיים לחזור לניידות בחדר התאוששות, כאשר תנוחת השכיבה נשמרת לאורך כל הדרך.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה עבור הליכי הכנה כלליים של תאי גזע המעורבים לפני הלידה התוך-אפית. (א-ג) טיפול מקדים היפוקסי או שינויים גנטיים של תאי גזע כדי לבטא יתר על המידה CXCR4. (ב-ד) שטיפה, דיסוציאציה אנזימטית, איסוף תאים ושלבי ספירה מבוצעים לטעינה הבאה של תאי גזע עם מטען טיפולי או אבחנתי. (E) ריאגנטים טיפוליים, כגון וירוסים אונקוליטיים, או עוקבים אבחנתיים, ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אספקת תרביות תאים (פלסטיק)	תרמופישר סיינטיפיק	משתנה	ניתן להחלפה בכל מקור
Legend Micro 21R מיקרו-צנטריפוגה בקירור	תרמופישר סיינטיפיק	75002490	ניתן להחלפה בכל מקור
צנטריפוגת ספסל Sorvall ST16R	תרמופישר סיינטיפיק	75004240	ניתן להחלפה בכל מקור