העברה תוך אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים (NSCs) במודל מורין: הליך למסירה ממוקדת גידול של NSCs טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר נושא גידול במוח

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. התניה מוקדמת היפוקסית של תאי גזע עצביים אנושיים (איור 1A)

1. לוחות מעובדים בתרבית צלחות בצלוחיות תרבית T75 עד שמגיעים למפגש של 90%.
2. הניחו צלוחיות תרבית תאים בתוך תא/אינקובטור CO₂ לח עם רמות O₂ מתוחזקות למשך 24 שעות, באמצעות אספקת גז N₂ הנשלטת על ידי מד זרימה מובנה אוטומטי. תאים אלה מכונים ^HNSCs. Control ^NNSCs נוצרים כ:
   1. שמור על NSCs אנושיים (שיבוט HB1.F3.CD) בתווך DMEM עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור לח של 37°C מתחת ל-95% אוויר בחדר ו-5% CO₂.

2. העמסת תאי גזע עצביים אנושיים עם וירוס אונקוליטי (איור 1B-1H)

1. להדביק ^NNSCs, ^HNSCs עם 50 אדנווירוס משוכפל מותנה (CRAd)-S-pk7 חלקיקים נגיפיים / תא.
2. לאחר שעתיים של דגירה בטמפרטורת החדר עם הקשה תקופתית, יש לשטוף תאים שלוש פעמים במדיה כדי להסיר חלקיקים נגיפיים לא קשורים ולהשהות תאים במי מלח סטריליים להזרקה.
   זהירות: לבצע את כל הליכי תרבית תאי המבחנה הקשורים לווירוס במתקנים עם ייעוד רמת הבטיחות הביולוגית המתאימה, כגון BSL2. חוקרים המטפלים בנגיף האונקוליטי חייבים ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בהתאם להנחיות המוסד למתקנים לבעלי חיים.

3. העברה תוך-אפית של תאי גזע גזעיים טיפוליים (איורים 1D ואיור 2D)

1. תרבות ואיסוף NSCs (^NNSCs, ^HNSCs).
2. מרדימים עכברים באמצעות הזרקת תערובת קטמין וקסילזין בהתאם לנוהל:
   1. מרדימים את בעל החיים על בסיס משקל הגוף באמצעות ריאגנטים מאושרים, כלומר, באמצעות הזרקה תוך צפקית (i.p.) של תערובת קטמין (50-100 מ"ג/ק"ג; יש להתייעץ עם IACUC מוסדי לגבי טווח המינונים המאושר) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג; להתייעץ עם IACUC מוסדי לגבי טווח המינונים המאושר) במי מלח סטריליים של 200-250 מיקרוליטר, או באמצעות הרדמה איזופלורנית 4-5% באמצעות מכשיר אינהלציוני.
3. הניחו עכברים על וילון נקי הפונה כלפי מעלה עם כרית חימום מתחתיו כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. התאימו כרית מרופדת העשויה ממגבות נייר מגולגלות בעזרת סרטים כדי להבטיח את הזווית הזקופה של הנחיריים כאשר הם מונחים מתחת לראש העכבר.
4. באמצעות מיקרופיפטה, לחלק 2 μL של מתלה NSC לכל נחיר של העכבר. לאשר חזותית את השאיפה של הטיפה לפני המעבר לעכבר הבא. המשתמש יכול לקבוע את המספר הכולל של התאים שנמסרו; להשתמש 62,500-125,000 תאים/μL, כך 0.5-1 מיליון תאים יכולים להיות מועברים במנות 4 x 2 μL.
5. השתמש בטיימר כדי להבטיח מרווחים של 5 דקות בין כל ניהול השעיה של התא, עד 4 פעמים.
6. אפשרו לבעלי חיים לחזור לניידות בחדר התאוששות, כאשר תנוחת השכיבה נשמרת לאורך כל הדרך.

איור 1: תרשים זרימה עבור הליכי הכנה כלליים של תאי גזע המעורבים לפני הלידה התוך-אפית. (א-ג) טיפול מקדים היפוקסי או שינויים גנטיים של תאי גזע כדי לבטא יתר על המידה CXCR4. (ב-ד) שטיפה, דיסוציאציה אנזימטית, איסוף תאים ושלבי ספירה מבוצעים לטעינה הבאה של תאי גזע עם מטען טיפולי או אבחנתי. (E) ריאגנטים טיפוליים, כגון וירוסים אונקוליטיים, או עוקבים אבחנתיים, כגון חלקיקי MPIO, יכולים להיטען בתאי גזע שנאספו בריכוזים מתאימים עם טלטול תקופתי ותסיסה עדינה (F). (ג'-ט') לאחר מכן ניתן לשטוף את תאי הגזע הטעונים ולספור אותם להעברה תוך אפית לעכברים.

איור 2: תרשים זרימה סכמטי של ההליכים הכלליים המעורבים בבעלי חיים. (A) מודלים של גידולים נוצרים באמצעות xenograft של תאי גליומה שמקורם בחולה. (B) צמיחת הגידול מנוטרת באמצעות BLI. (C) ניתן טיפול הקרנה לראש בלבד (D) יציבת השכיבה והטיה של הראש נשמרת במהלך מסירת תאי גזע תוך אפיים טיפוליים. (E) מעקב הישרדות לאחר הטיפול, הדמיה של בעלי חיים קטנים וניתוח היסטולוגי של רקמות במידת הצורך.