יצירת מיקרו-גידולים: טכניקת תרבית חוץ גופית לתרבית מיקרו-גידולים תלת-ממדיים לניתוח תגובה לטיפול תרופתי

תקציר

מקור: Gilbert, A. N. et al. יצירת מיקרו-גידולים באמצעות מערכת תלת-ממדית של תרביות ביוג'ל אנושיות ותאי גליובלסטומה שמקורם במטופל לצורך יצירת פרופיל קינומי ובדיקת תגובה לתרופות. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה, אנו מייצרים מיקרו-גידולים מתאי גידול שמקורם במטופל באמצעות ביוג'ל אנושי תלת-ממדי. מיקרו-גידולים אלה דומים מאוד למיקרו-סביבה של הגידול in vivo ומשמשים פלטפורמות פוטנציאליות לבדיקות תרופות.

פרוטוקול

1. יצירת מיקרו-גידולים

1. הכנת ריאגנטים
   1. הכינו NBM מלא על ידי הוספת הפריטים הבאים לבקבוק אחד של 500 מ"ל של מדיה נוירובזלית (NBM) להכנת NBM מלא: תוסף B-27 של 10 מ"ל ללא ויטמין A, תוסף N2 של 5 מ"ל, 100 מיקרוליטר EGF, 100 מיקרוליטר גורם גדילה פיברובלסט (FGF)-בסיסי, 5 מ"ל אמפוטריצין B, 0.5 מ"ל גנטמיצין, 5 מ"ל L-גלוטמין והכן ביוג'ל אנושי מנוטרל בצפיפות גבוהה (HuBiogel) (HDHG ב 3 מ"ג / מ"ל) לכל פרוטוקול פנימי. ניתן להשתמש גם במטריצות ביוג'ל דומות.
2. ייצור מיקרו-גידולים ותרבית
   1. קבל תאי PDX מנותקים טריים כתרחיף של תא בודד ב- NBM מלא, על קרח.
   2. ערבבו את תרחיף התא עם נפח שווה של תמיסה כחולה טריפאן (0.4% ב-PBS) ונתחו באמצעות המוציטומטר כדי לקבוע את מספר התא ואת הכדאיות שלו על ידי אי הכללת כחול טריפאן. הסר את הנפח הדרוש ליצירת 50,000 תאים/מיקרו-גידול כאשר נפח = (50,000 תאים/גידול * # גידולים)/(ספירת תאים בת קיימא / 1 מ"ל) והכנס לצינור חרוטי טרי.
   3. רכז תאים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 150 x גרם, למשך 8 דקות, בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא עם תמיסת HDHG קרה כקרח ביחס סופי של 1 תאי חלק ב-FBS ו-4 חלקים HDHG.
   4. השתמש פיפטה רב-ערוצית אלקטרונית כדי לפזר תערובת HDHG של 10 μL לכל פין על לוח פלדה של 96 פינים (עם ציפוי הידרופובי) כדי ליצור מיקרו-גידולים (חרוזי 2 מ"מ שכל אחד מהם מכיל 50,000 תאים).
   5. הניחו חרוזי גידול תלת-ממדיים בתוך אינקובטור תרביות רקמה (37°C, 5% CO₂, לח) למשך 15 דקות כדי ללטש את החרוזים.
   6. לאחר הג'לציה, מעבירים את המיקרו-גידולים (10 μL) לתא תרבית תרחיף מותאם אישית (50 מ"ל) או לצלחת תרבית בנפח גדול (10 ס"מ) המכילה NBM שלם באמצעות פיפטה אלקטרונית רב ערוצית ומכשיר סיכה מותאם אישית.
   7. לאחר 1-2 ימים באינקובטור תרביות רקמה, מעבירים מיקרו-גידולים לצלחות תרבית 96 בארות המכילות 50 μL NBM/well באמצעות פיפטה רחבת פה ומבצעים פרוטוקולי בדיקה וניתוח שונים.
3. טיפול תרופתי ותחזוקה של מיקרו-גידולים
   1. בחר ריכוזים סופיים לבדיקת סמים.
      הערה: אם התרופה ידועה כיעילות בתרבית דו-ממדית, בחר פי 2 IC50 כריכוז המינון האמצעי ובחר דילולים סדרתיים פי 3 מעל ומתחת לסך כולל של 5 רמות מנה. לדוגמה, אם IC50 הוא 9 מיקרומטר עבור התרופה בתרבית דו-ממדית, בחר 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM ו- 162 μM כריכוז הסופי לבדיקת סמים.
   2. הכינו 2x תמיסת מינון תרופות ב-NBM מלא ממלאי דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לדלל את תמיסת המינון ב-1% DMSO בינוני להכנת דילול טורי של 5 מנות, פי 3.
   3. הוסף 50 μL של תמיסת מינון לבאר microtumor המכיל 50 μL בלוחות הבדיקה כדי להשיג ריכוז DMSO סופי של 0.5%. חזור על הפעולה עבור כל שכפול (למשל, 4) בכל מינון תרופה שנקבע בשלב 1.3.1.
   4. שמור על תרביות ב 37 ° C, 5% CO₂, אינקובטור תרבית רקמות לחות במשך 1-14 ימים. להאכיל תרביות פעמיים בשבוע על ידי רענון מדיה ותמיסת תרופות כנ"ל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קולגנאז-I	סיגמא-אולדריץ'	CO130
נוירובזל-A	לייף טכנולוגיות	10888-022
תוספת N-2	לייף טכנולוגיות	17502-048	1x ריכוז סופי
תוסף B-27 עם ויטמין A	לייף טכנולוגיות	12587-010	1x ריכוז סופי
רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי	לייף טכנולוגיות	PHG0266	ריכוז סופי של 10 נ"ג/מ"ל
ל-גלוטמין	קורנינג סלגרו מדיטק	25-005-CI	ריכוז סופי של 2 מ"מ
גנטמיצין	לייף טכנולוגיות	15750-060	50 נ"ג/מ"ל ריכוז סופי
כחול טריפאן	פירס תרמוסיינטיפיק	15250-061
הוביוג'ל בצפיפות גבוהה	Vivo Biosciences	HDHG-5
DMSO	פישר	BP231	לפירוק calcein AM & תרכובות
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco עם Ca/Mg	קורנינג סלגרו מדיטק	20-030-CV	מדולל עד 1x עם מים אולטרה-טהורים MiliQ (לשטיפה לפני קיבוע)
10% פורמלין חוצץ ניטרלי	פרוטוקול	032-060
צלחות פטרי זכוכית 100 מ"מ	פישר	08-748ד