השראת גליובלסטומה באמצעות טרנספוזיציה בתיווך SB: טכניקה ליצירת מודל עכבר חדשני באמצעות שילוב מתווך טרנספוזון של פלסמיד SB במוח עכבר יילודים

תקציר

מקור: Calinescu, A. A. et al. Transposon תיווך אינטגרציה של DNA פלסמיד לאזור התת-חדרי של עכברים ילודים כדי ליצור מודלים חדשים של גליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר טכניקה יעילה לגרימת גליובלסטומות (GBM) באמצעות דנ"א טרנספוזוני המוזרק לחדרים של עכברים ילודים. תאים של האזור התת חדרי, אשר לוקחים את פלסמיד, לשנות, להתרבות וליצור גידולים עם מאפיינים היסטופתולוגיים של GBM אנושי.

פרוטוקול

1. זריקות יילודים תוך חדריים

1. שלושה עד ארבעה שבועות לפני הניסוי, הקימו כלוב רבייה של עכברים עם עכבר זכר אחד ונקבה אחת, ואיגלו בצבע פלסטיק. זה מספק סביבה מועשרת ומסייע בתהליך ההזדווגות.
2. כאשר ההריון מאושר, להוציא את הזכר לכלוב חדש. שמונה-עשר יום לאחר ההזדווגות, יש לפקח על הכלוב מדי יום לצורך הלידה. לבצע זריקות תוך חדריות ביום שלאחר הלידה 1(P1).
3. הכנת תמיסת ההזרקה.
   הערה: פתרון ההזרקה נעשה על ידי ערבוב DNA פלסמיד עם מגיב transfection כדי ליצור את החלקיקים עבור transfection. להלן דוגמה להכנת תמיסת הזרקה באמצעות פלסמיד המקודד את טרנספוזאז היפהפייה הנרדמת ולוציפראז: pT2/SB100x-Luc ושני פלסמידים טרנספוזונים: pT/CAGGS-NRASV12 ו-pT/CMV-SV40-LgT, ביחס של 1:2:2. לכל הפלסמידים יש ריכוז של 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
   1. הכן את תמיסת ה- DNA על ידי הוספה: 4 מיקרוגרם (2 μL) של pT2/SB100x-Luc, 8 מיקרוגרם (4 μL) של pT/CAGGS-NRASV12 ו- 8 מיקרוגרם (4 μL) של pT/CMV-SV40-LgT ו- 10 מיקרוליטר של 10% גלוקוז לנפח סופי של 20 μL בריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל DNA ו- 5% גלוקוז.
   2. הכן את תמיסת PEI על ידי הוספת 2.8 μL של in vivo jet PEI, 7.2 μL של מים סטריליים, ו 10 μL של 10% גלוקוז לריכוז סופי של 5% גלוקוז.
   3. הוסף את תמיסת PEI לתמיסת ה- DNA, ערבב ומערבל ותן לשבת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות. הפתרון מוכן כעת להזרקה. לאחר שעה ב- RT, שמור את הפתרון על קרח.
   4. התאימו מזרק נקי של 10 μL המצויד במחט היפודרמית של 30G עם שיפוע של 12.5° לתוך המיקרו-משאבה (איור 1 #1).
4. כדי לוודא תפקוד תקין של מערכת ההזרקה, השתמשו במזרק האוטומטי (איור 1 #1) כדי למשוך 10 מיקרוליטר מים לתוך המזרק ואז רוקנו את המזרק לחלוטין.
5. קררו את השלב הסטריאוטקסי של היילוד (איור 1 #3) עם תרחיף של קרח יבש ואלכוהול לטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
6. יש להשרות הרדמה על ידי הנחת הגורים על קרח רטוב למשך 2 דקות. ההרדמה תימשך במסגרת הסטריאוטקסית המצוננת למשך שארית ההליך. שמירה על טמפרטורת המסגרת מעל לאפס, בין 2-8 מעלות צלזיוס תמנע פציעות כוויות תרמיות. כאמצעי זהירות מיוחד, ניתן לעטוף גורים בגזה לפני הנחתם על קרח רטוב.
7. מלאו את המזרק בתמיסת DNA/PEI.
8. השתיקו את הגור במסגרת הסטריאוטקסית על-ידי הנחת ראשו בין מוטות האוזניים המכוסים בגזה (איור 1b). ודא שהצד הגבי של הגולגולת אופקי, מקביל לפני השטח של המסגרת ושהתפרים הגולגולתיים נראים בבירור. נגבו את הראש עם 70% אתנול.
9. הנמיכו את המחט של המזרק וכווננו קואורדינטות סטריאוטקסיות באמצעות חוגות של המסגרת הסטריאוטקסית עד שהמחט נוגעת בלמבדה (הצטלבות קו האמצע של עצמות הקודקוד והעורף) (איור 1b).
10. הרימו את המחט וכווננו קואורדינטות סטריאוטקסיות לרוחב 0.8 מ"מ ורוסטרל 1.5 מ"מ ללמדא (איור 1b).
11. מנמיכים את המחט עד שהיא נוגעת ומעט גומות חן בעור. מדוד את הקואורדינטות. מורידים את המחט עוד 1.5 מ"מ. המחט תנקב את העור והגולגולת, ותעבור דרך קליפת המוח כדי להיכנס לחדר הצידי (איור 1c).
12. באמצעות המזרק האוטומטי, הזריקו 0.75 μL של תמיסת DNA/PEI בקצב של 0.5 μL/min.
13. השאירו את הגור על המסגרת למשך דקה נוספת כדי לאפשר לתמיסה להתפזר לתוך החדרים. בינתיים, מרדימים גור נוסף, על קרח למשך 2 דקות לקראת הזריקה הבאה.
14. הרימו בעדינות ובאיטיות את המחט, והניחו את הגור מתחת למנורת חימום. עקוב אחר נשימה ופעילות. במידת הצורך, לספק גירוי עדין של הגפיים עד הנשימה הראשונה הבאה.
15. החזירו את הגור לאמו לאחר שהתחמם, הגיע לצבע ורוד, נושם באופן סדיר ופעיל, בדרך כלל 5-7 דקות. אם יותר מגור אחד מוזרק בכל פעם, יש לשמור את כל הגורים יחד עד לביצוע כל הזריקות. אם הזריקות נמשכות יותר מ-30 דקות, החזירו מחצית מהגורים לאחר 30 הדקות הראשונות ואת השאר בסוף ההליך.
16. שימו לב שהסכר מגיב ומטפח את הגורים שלו. במידת הצורך, הוסיפו אם פונדקאית לכלוב.
17. ודאו שהמרווח בין הנחת הגור על קרח לבין הנחתו מתחת למנורת החימום הוא פחות מ-10 דקות. ככל שההליך מהיר יותר, כך ההישרדות טובה יותר. בדרך כלל, הזמן שלוקח להרדים ולהזריק גור הוא 4 דקות.

תוצאות

איור 1: מערך ניסויי ומדריכים לזריקות תוך-חדריות בעכברי יילודים. (א)מסגרת סטריאוטקסית (2) עם חוגות מיקרומטר מצוידת במזרק אוטומטי המחזיק מזרק 10 μl (4). בתוך מסגרת U, מסגרת מתאם יילודים מהודקת היטב (3). לוח הבקרה של המזרק האוטומטי (1) מאפשר בחירה מדויקת של המזרק, נפח וקצב זרימה. (ב) צילום עכבר יילוד (P1) עם מחט המוחדרת בקואורדינטות הדרושות להזרקה לחדר הצידי: 1.5 מ"מ גח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תקן Lab של Stoelting עם מתאמי חולדות ועכבר	סטולטינג	51670	חברות אחרות מייצרות מסגרות דומות, כל אחת מהן עם מתאמי עכבר קטנים מתאימה
מזרק סטריאוטקסי מובהק (QSI)	סטולטינג	53311	זריקות ניתן לבצע בלעדיו, אבל מזרק אוטומטי מאפשר שחזור מוגבר ונוחות
מזרק MICROLITER מסדרת 10 μL 700 בעבודת יד	המילטון	דגם 701	דגם מזרק זה יספק בין 0.5 ל 500 μL של פתרון אמין. ניתן להשתמש גם במזרקים אחרים (לדוגמה 5 μL, דגם 75)
30 מד מחט היפודרמית (1.25", 15^{o} שיפוע)	המילטון	S/O# 197462	מחט זו אידיאלית לחדור את העור ואת הגולגולת של עכבר יילוד ללא צורך בהליכים פולשניים אחרים. אם הוא נעשה עמום (לא נכנס בקלות לעור), יש להחליפו.
In vivo jet PEI	פוליפלוס טרנספקציה	201-10 גרם	Aliquot בכמויות קטנות ולשמור על -20ºC
D-לוציפרין, מלח אשלגן	Goldbio.com	LuckK-1g	מקורות אחרים של lucifierase גחלילית הם מספיקים באותה מידה
פתרון Hematoxylin, האריס שונה	סיגמא אולדריץ'	HHS128-4L