$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דיסקציה
הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים אלא אם כן כלי הדם משמשים למטרות תרבית תאים. להכין פתרונות כלי בידוד: B1, להוסיף 1.5 מ"ל של HEPES 1M עד 150 מ"ל של HBSS; B2, להוסיף 3.6 גרם של Dextran ל 20 מ"ל של B1; B3, להוסיף 1 גרם של BSA ל 100 מ"ל של B1.
- הכינו של 150 מ"ל עם 20 מ"ל של B1. יש לשמור על קרח ולכסות בפרפילם כדי למנוע זיהום אוויר.
- מרדימים עמוקות את העכבר מתחת למכסה מנוע עם מגבת נייר קטנה ספוגה ב 1 מ"ל של איזופלורן טהור שנוסף לכלוב. הרדמה מאומתת על ידי חוסר תגובה לצביטת בוהן. להרוג את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם.
הערה: צעדים אלה נעשים בהתאם לתקנות לאומיות ומוסדיות.
- אופציונלי: בצע זילוח תוך לבבי עם 20 מ"ל של PBS 1x כדי לחסל את תכולת הדם.
- חותכים את העור עם אזמל מהצוואר אל האף ומושכים אותו משם. הסר את כל השערות המזהמות עם PBS 1x.
- כדי לפתוח את הגולגולת, ראשית, הכנס מספריים קדמית לפקעת הריח, ופתח את המספריים כדי לקרוע את הגולגולת לשני חלקים.
- בזהירות להסיר את המוח באמצעות מרית המוח. נתחו את מקלעת הכורואיד מהחדרים הצידיים מכיוון שהם יזהמו את הכנת כלי הדם.
הערה: אופציונלי: ההכנה הסופית תכיל כלי parenchymal ו קרומי המוח. אם לא רוצים, ניתן לקלף את קרומי המוח.
- העבירו את המוח לתוך הכד המכיל תמיסת B1 על קרח. ניתן לטפל יחד בעד 8 מוחות.
2. הומוגניזציה של רקמת המוח
- באמצעות שני אזמלים, באופן ידני ונמרץ להכות את המוח בתמיסת B1 לאחר מכן קבלת חתיכות קטנות של כ 2 מ"מ.
- הומוגניזציה של ההכנה עם הומוגנייזר Dounce אוטומטי, ביצוע 20 פעימות ב 400 סל"ד. ודא כי צינור הזכוכית נשמר בקרח וכי החלק העליון של המשדר נמצא בתמיסה בעת תנועה למעלה ולמטה, כדי למנוע היווצרות כיסי אוויר. אם מכינים מספר דגימות, שוטפים את הסדרן במים מיוננים בין כל הומוגניזציה.
3. טיהור כלי דם
- מעבירים את ההומוגנאט לתוך צינור פלסטיק של 50 מ"ל וממשיכים לצנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. ממשק לבן גדול (בעיקר מיאלין) ייווצר בחלק העליון של גלולת הכלי (אדום אם לא בוצע זילוח).
- השליכו את הסופרנטנט. גלולת הכלי והממשק הלבן יישארו מחוברים זה לזה. הוסף 20 מ"ל של תמיסת B2 קרה כקרח ונער את הצינור באופן ידני ונמרץ במשך דקה אחת.
- המשך לצנטריפוגה השנייה ב 4,400 x גרם למשך 15 דקות ב 4 ° C. המיאלין ייצור כעת שכבה לבנה צפופה על פני השטח של הסופרנטנט.
- נתקו בזהירות את שכבת המיאלין מדפנות הצינור על ידי אחיזת הצינור וסיבובו האיטי כדי לאפשר לסופרנאטנט לעבור לאורך הדפנות. השליכו את המיאלין עם הסופרנטנט. הגלולה המכילה את הכלים נשארת מחוברת בתחתית הצינור.
- כתם את הקיר הפנימי של הצינור עם נייר סופג עטוף סביב פיפטה פלסטיק 5 מ"ל ולהסיר את כל שאריות נוזלים, להימנע מלגעת בכדורית כלי. שמור את הצינור הפוך על נייר סופג כדי לנקז את שאריות הנוזלים.
- להשהות את הגלולה ב 1 מ"ל של תמיסת B3 קרה כקרח על ידי pipeting למעלה ולמטה עם קצוות קשירה נמוכה, שמירה על הצינור על קרח, ולאחר מכן להוסיף עוד 5 מ"ל של תמיסת B3. יש לוודא כי כלי השיט מפוזרים ככל האפשר ואינם יוצרים אגרגטים.
4. סינון
- הכינו על קרח עם 30 מ"ל של תמיסת B3 קרה כקרח. מכסים בפרפילם כדי למנוע זיהום אוויר.
- הניחו מסנן רשת של 20 מיקרומטר על מחזיק מסנן שעבר שינוי בחלק העליון של בקבוק בקר ואזנו אותו על ידי מריחת 10 מ"ל של תמיסת B3 קרה כקרח.
- יוצקים את הכנת הכלי על המסנן ושוטפים את הכלים עם 40 מ"ל של תמיסת B3 קרה כקרח.
- שחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים ומיד לטבול אותו בכד המכיל את תמיסת B3. נתקו את הכלים מהמסנן על ידי ניעור עדין שלו.
- מזגו את תכולת הכד לצינור פלסטיק של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 2,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C.
הערה: לחלופין, ניתן לסנן את המתלה של כלי הדם במוח משלב 3.6 על מסנן רשת של 100 מיקרומטר. במקרה זה, כלים גדולים יותר נשמרים באופן מועדף על המסנן, בעוד זרימת דרך מכיל microvessels (בעיקר נימים), אשר מסוננים לאחר מכן על מסנן 20 מיקרומטר רשת כאמור לעיל.
- Resuspend את הגלולה של microvessels ב 1 מ"ל של פתרון B3 קר כקרח ולהעביר אותו על ידי pipeting אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.