מאמר שיטה

בדיקת פגוציטוזה חוץ גופית: שיטה מבוססת הדמיה חיה לחקר פנפטוזיס סינפטוזום בתיווך אסטרוציטים בזמן אמת

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מעריכים את היכולת הפאגוציטית של אסטרוציטים מטוהרים במבחנה על ידי בדיקת הדמיה חיה. הבדיקה משמשת כפלטפורמת סינון יעילה לזיהוי תרכובות כימיות שיכולות לשפר או לעכב את היכולת הפאגוציטית של אסטרוציטים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקת פאגוציטוזיס הדמיה חיה (איור 1)

  1. הכינו צלחת בת 24 בארות (או כל צלחת/צלחת שהוכנה להדמיה חיה) שבה אסטרוציטים נמצאים במפגש (בדרך כלל, 7 עד 10 ימי דגירה לאחר הטיהור אידיאליים לייצוב התאים).
  2. הסר את המדיה בכל באר ושטוף את הבארות עם 1 מ"ל של מלח חיץ פוספט של Dulbecco (DPBS), שלוש פעמים. כדי למזער את החשיפה לאוויר, שטפו את הבארות במהירות.
  3. הוסף 300 μL של מדיה בסיסית של אסטרוציטים אימונופנים (IP-ABM) עם 5 μL של סינפטוזומים מצומדים של אינדיקטור pH וגורמים נוספים כגון מדיה מותנית אסטרוציטים חיסונית (IP-ACM) שיכולה לווסת פגוציטוזה של תאי גלייה.
  4. דוגרים על הצלחת באינקובטור CO2 למשך 40 דקות. שלב זה מאפשר לסינפטוזומים מצומדים של מחוון pH להתיישב לתחתית הלוחות.
  5. הסר את המדיה עם סינפטוזומים מצומדים של מחוון pH לא מאוגד ושטוף כל באר עם 1 מ"ל של DPBS, שלוש פעמים.
    זהירות: אין לשטוף בחוזקה. כדי למזער את החשיפה לאוויר, שטפו את הבארות במהירות.
  6. הוסף 500 μL של IP-ABM עם גורמים נוספים לבדיקה לתוך הבארות.
  7. קח את הצלחת למכשיר הדמיה חיה ובחר מיקומים. התאם את המיקוד, זמן החשיפה, הבהירות ועוצמת ה-LED.
    הערה: ההגדרות של זמן החשיפה, הבהירות והספק ה-LED משתנות בהתאם לעוצמת הפלואורסצנטיות ומטרת הניסוי. בבדיקת הדמיה חיה עם סינפטוזומים מצומדים של מחוון pH, אנו בדרך כלל קובעים ערכים אלה כדלקמן: חשיפה: ~ 150-200 אלפיות השנייה, בהירות: 15, והספק LED: 4-6.
  8. הגדר את תבנית התמונה, מרווח הזמן ואת מספר המחזורים הכולל להדמיה חיה. הגדר את מרווח הזמן לשעה או שעתיים, בהתאם למספר המיקומים שנבחרו. מומלץ לבצע מרווחים של שעתיים כאשר נבחרים יותר מ-150 עמדות להדמיה חיה.
  9. התחל את ניסויי ההדמיה החיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. סכמטי של בדיקת הדמיה חיה של פגוציטוזיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pHrodo אדום, succinimidyl ester בדיקות מולקולה P36600עבור צימוד מחוון pH
סרום בקר עוברי (FBS) גיבקו16000-044
DMEMגיבקו11960-044
dPBSוולג'ין LB001-02
בדיקת הדמיה חיה של פגוציטוזה
ג'ולי סטייגננואנטק
תוספי Time Series Analyzer V3 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html
'

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pH

מאמרים קשורים