Ex vivo electroporation of Chick Embryo Cerebellar Slices: שיטה להחדרת DNA פלסמיד המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לדמיין התפתחות תאים גרגיריים

תקציר

מקור: Hanzel, M. et al.Ex vivo תרבית של פרוסות אפרוחים במוח הקטן ואלקטרופורציה ממוקדת מרחבית של מבשרי תאי גרגיר.J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מבצעים אלקטרופורציה של פרוסות המוח הקטן של עובר אפרוח עם פלסמידים של גן כתב. הטכניקה מאפשרת הדמיה של התפתחות והגירה של מבשרי תאי גרגיר ליצירת שכבה גרעינית.

פרוטוקול

1. אלקטרופורציה של פרוסות

1. בניית תא אלקטרופורציה על ידי קיבוע האנודה של אלקטרופורטור לבסיס צלחת פטרי 60 מ"מ עם סרט בידוד. הוסף בערך 1 מ"ל של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה.
2. הניחו תרבית של 0.4 מיקרומטר על גבי האלקטרודה המכוסה ב-HBSS. אפשר לעלון התרבית לנוח על האלקטרודה וודא שתמיד יש מגע בין העלון לבין האלקטרודה.
   הערה: במערך זה, תוספת התרבית עם הפרוסות תונח על פני השטח של התמיסה, תוך שמירה על המעגל אך מאפשרת מיקוד מרחבי של הקתודה.
3. מעבירים פרוסות מזוהות (עד חמש בכל תוספת תרבית) לתוספת תרבית בעזרת פיפטה פסטר בנפח 3 מ"ל עם קצה החתוך. להפריד ולאפשר להתיישב על תרבות להכניס בכיוון sagittal.
4. בעזרת פיפטה, מוציאים עודפי HBSS כך שהפרוסות כבר לא יהיו שטופות בתמיסה.
5. באמצעות קצה פיפטה P10, פיפטה DNA (בריכוז של 1 מיקרוגרם/μL) מדוללת בירוק מהיר 20% על פני השטח של אזור היעד של פרוסה. ירוק מהיר 20% מבטיח תמיסת DNA צמיגה ומונע פיזור רחב מדי של DNA. הוסיפו כ-5 μL DNA/תמיסה ירוקה מהירה לכל פרוסה (איור 1B).
6. מניחים את הקתודה מעל הרקמה הממוקדת הרצויה ומתחשמלים עם פולסים של 3 x 10 V, 10 msec duration. הימנע ממגע ישיר של הקתודה עם הרקמה. במקום זאת, נצלו את מתח הפנים של הנוזל כדי לשמור על מוליכות (הניחו את הקתודה קרוב ככל האפשר לרקמה מבלי לגעת ברקמה).
7. חזור על העברת DNA ואלקטרופורציה לאזורים מרובים של EGL על כל פרוסה צרבלרית בודדת לפי הצורך.
8. עם סיום ההתחשמלות, מעבירים את תרבית ההדבקה לצלחת פטרי בקוטר 30 מ"מ.
9. לכל תרבית, יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש (Basal Medium Eagle, 0.5% (w/v) D-(+)-glucose, 1% תוסף B27, 2 mM L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) מתחת לעלון התרבית כך שתוספת התרבית תהיה במגע עם מדיום, אך פרוסות לא ירחצו בה.
10. לדגור על תרביות בטמפרטורה של 37°C/6% CO₂ למשך עד 3 ימים. החליפו את כל מדיום התרבית כל 24 שעות במדיום טרי שחומם מראש.
11. לאחר התרבית, יש לקבע פרוסות על תוספות תרבית למשך שעה אחת ב-4% פרפורמלדהיד (או O/N ב-4°C) בכלי טרי בקוטר 30 מ"מ ללא תרבית.

תוצאות

איור 1. תא האלקטרופורציה שהוקם. (A) תמונה של תא האלקטרופורציה בהתאמה אישית. התא מורכב מאנודה של אלקטרופורטור המונחת היטב על בסיס צלחת פטרי 60 מ"מ. המנה מכילה כ 1 מ"ל של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה. תוספת התרבית צריכה להישען על האלקטרודה עם מגע מתמיד בין האינסרט לאלקטרודה, לשמור על המעגל אך לאפשר מיקוד מרחבי של הקתודה, אשר מנוצל ביד. (B) תמונה של פרוס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עיט בינוני בזאלי (Gibco)	לייף טכנולוגיות	41010-026
ל-גלוטמין	סיגמא	G7513
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא	עמ' 4333
תוספת תרבית של 0.4 מיקרומטר	מיליפור	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne אלקטרופורטור	אינטרסל	01-916-02	השתמש 3 x 10 V 10 msec פולסים עבור electroporation.