דיסקציה של המוח הקטן והכנת פרוסות: שיטה ליצירת פרוסות רקמה מהמוח הקטן של העכבר

תקציר

מקור: Thetiot, M. et al. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון וידאו זה מתאר שיטה ליצירת פרוסות רקמה מהמוח הקטן של העכבר. פרוסות המוח הקטן יכולות לשמש לתרבית אורגנוטיפית המספקת תובנות לגבי מנגנונים נוירו-התפתחותיים, כולל דינמיקה של מיאלינציה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דיסקציה של המוח הקטן והכנת מקטעים (זמן מעשי ≈ 15-20 דקות לכל חיה)

1. הניחו את אחת מתרביות התאים בקוטר 60 מ"מ המכילות את מדיום הדיסקציה הקר כקרח מתחת למיקרוסקופ הדו-עיני והוציאו את הצלחת העליונה.
2. יש לספוג את פרוות הראש עם 70% אתנול (בזהירות להימנע מלגעת בעיני החיה) ולערוף את ראשו של בעל החיים באמצעות מספריים גדולים וחדים, על פי הנוהל המאושר.
   הערה: פרוסות המוח הקטן נוצרות מעכברי P9-P10 ללא הטיית מין או זן ספציפית.
3. השתמש מספריים קטנים כדי לחתוך את העור לאורך קו האמצע של הראש, החל מהצוואר ועולה אל לוע העכבר.
4. כדי להחזיק את הראש ולחשוף את הגולגולת, קפלו את העור לאחור מתחת לראש, וצבטו את שני קפלי העור בין האצבעות.
5. הכניסו את המספריים הקטנים בעדינות לתוך הפתח מגנום וחתכו את הגולגולת על ידי ביצוע חתך רוחבי אחד לכיוון הצד ואז חתכו את כל גולגולת הראש. שמרו על קצה המספריים מקביל וקרוב ככל האפשר לגולגולת בזמן החיתוך, כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח.
6. שלוף את החלק הגבי של הגולגולת באמצעות מלקחיים ישרים עדינים. תוך כדי הרמה זהירה של החלק הגבי של הגולגולת, חתכו את קרומי המוח הנצמדים (קרום השקיה שקוף המקיף את רקמת המוח) במידת הצורך עם מספריים קטנים כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח.
7. הכניסו בזהירות מלקחיים דקיקים ישרים (או לחילופין השתמשו במרית) בין הגולגולת הגחונית למוח, הפכו בעדינות את המוח וחתכו את עצבי הראייה והטריגמינל בעזרת מספריים קטנים.
8. עזרו למוח לצנוח בכוח הכבידה לתוך צלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המכילה מדיום דיסקציה קר כקרח על ידי הפיכת הראש ממש מעל הצלחת ושחרור ההידבקויות האחרונות בעזרת מספריים קטנים במידת הצורך.
9. בעזרת מלקחיים עדינים, כוונו את המוח כאשר הצד הגבי פונה לחוקר, והצד הגחוני שוכב על תחתית המנה.
10. מתחת למיקרוסקופ הדו-עיני, השתמשו במלקחיים הישרים כדי לשתק את המוח בצד הקדמי של המוח ולהימנע מלגעת במוח האחורי, מכיוון שהוא עלול להינזק. הפרידו את המוח האחורי משאר המוח (המוח הקדמי והאמצעי, ראו סכמה באיור 1Aa), באמצעות מלקחיים דקיקים. כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח האחורי, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לחתוך את הפדונקים של המוח הקטן מתחת למוח הקטן (ראו סכמה באיור 1Aa').
11. ברגע שהמוח הקטן מבודד, קרעו בזהירות את קרומי המוח באמצעות מלקחיים דקיקים (ראו סכמה באיור 1Aa').
12. החזיקו את המוח הקטן בעדינות עם המלקחיים המעוקלים והעדינים והניחו אותו עם הצד הגבי למעלה על משטח הפלסטיק בניצב לסכין הגילוח של המסוק (ראו סכמה באיור 1Bb).
13. יש לשאוף כל עודף של תווך דיסקציה סביב המוח הקטן באמצעות קצה פיפטה סטרילי דק המותאם על פיפטה בנפח 1 מ"ל (ראו סכמה באיור 1Bb).
14. ודאו שהמוח הקטן מונח שטוח, אך אינו מתוח, ברגע שהוא מונח על המשטח כדי לקבל פרוסות קשת אופטימליות במהלך החתך (ראו סכמה באיור 1Bb).
15. חתכו חתכים סגיטליים בעובי 300 מיקרומטר של המוח הקטן עם מסוק הרקמה (ראו סכמה באיור 1Bb'). הכוח והמהירות של הלהב צריכים להיות אופטימליים באתר.
16. מוסיפים בעדינות טיפה של אמצעי דיסקציה על המוח הקטן הפרוס. בעזרת קצה פיפטה רחב המונחת על פיפטה בנפח 1 מ"ל, שאפו באיטיות את המוח הקטן החתוך והעבירו אותו חזרה לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המכילה מדיום דיסקציה קר כקרח (ראו סכמה באיור 1Bb).
17. נקו את מצע הפלסטיק של מסוק הרקמה עם 100% אתנול בין כל חיתוך במוח הקטן. תנו לאתנול להתאדות לפני שתניחו את המוח הקטן הבא על הרציף.
18. השתמשו בשתי מלקחיים ישרות ועדינות (או לחילופין מחטי טיטניום) כדי להפריד פרוסות בודדות ובחרו 6–8 פרוסות מהוורמיס (ראו סכמה באיור 1Cc ו-1Cc').
19. קחו צלחת בת 6 בארות עם תוספות תרבית והעבירו עד 4 פרוסות נבחרות לתוספת תרבית אחת יחד עם אמצעי דיסקציה כלשהו, באמצעות קצה פיפטה רחב משעמם המותאם על פיפטה של 1 מ"ל (ראו סכמה באיור 1Cc').
20. הניחו את הפרוסות במרכז תוספת התרבית באמצעות מדיום הדיסקציה או מלקחיים כדי לדחוף ולמשוך אותן בעדינות למיקום הנכון, תוך הימנעות ממגע ביניהן (ראו סכמה באיור 1Cc').
21. הסירו את עודפי הדיסקציה סביב הפרוסות בעזרת קצה פיפטה דק. ודאו שהפרוסות מונחות שטוחות על הממברנה (ראו סכמה באיור 1Cc').
22. מניחים את צלחת 6 בארות לתוך האינקובטור מיד לאחר הוספת פרוסות על הממברנה.

תוצאות

איור 1: איור של יצירת פרוסות המוח הקטן. הדיסקציה מחולקת לשלושה שלבים עיקריים. (A) המוח הקטן מבודד, וקרומי המוח מוסרים (שלבים 1.10 ו-1.11). (B) המוח הקטן מועבר למשטח המסוק ופורס אותו (שלבים 1.12 עד 1.16). (C) לבסוף, הפרוסות מבודדות מהוורמיס ומונחות על ממברנה נוספת. אמצעי הדיסקציה המועבר עם הפרוסות מוסר וצלחת 6 הקידוחים מוכנסת לאינקובט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום BME	תרמופישר סיינטיפיק	41010026
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (10x HBSS)	תרמופישר סיינטיפיק	14180046
GlutaMAX (פי 100)	תרמופישר סיינטיפיק	35050038
סרום סוסים מנוטרל חום	תרמופישר סיינטיפיק	26050088
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחב"ל/מ"ל)	תרמופישר סיינטיפיק	15140122
תמיסת המלח המאוזנת של Gey	סיגמא אולדריץ'	G9779-500ML
תמיסת D-גלוקוז (45%)	סיגמא אולדריץ'	G8769-100ML
פרפורמאלדהיד (PFA)	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15714
אתנול מוחלט (100% אתנול)	VWR כימיקלים	20821.33
טריטון® X-100	סיגמא אולדריץ'	X100-500ML	מקורר ב-20°C
10% סרום עיזים רגיל (NGS)	תרמופישר סיינטיפיק	500622
תמיסת חיץ פוספט	EuroMEDEX	ET330-A
מסוק רקמות	מק'ילווין		pH 7.4
סכיני גילוח
מספריים גדולים	פ.ס.ט	14101-14
מספריים קטנים	פ.ס.ט	91500-09
מלקחיים עדינים-ישרים	פ.ס.ט	91150-20
מלקחיים מעוקלים ועדינים	פ.ס.ט	11297-00
כלים לתרביות תאים (60 מ"מ ו-100 מ"מ)	TPP
צלחות תרבות 4, 6 בארות	TPP
תוספות תרבית מיליצל (0.4 מיקרומטר, קוטר 30 מ"מ)	מרק מיליפור	PICM0RG50
אינקובטור תרביות תאים
טיפים עדינים לפיפטה	דוטשר	134000 CL	37°C, 5% CO2
קצוות פיפטה רחבים	תרמופישר סיינטיפיק	2079ז
מזרק סטרילי	Terumo אירופה
מסנני מזרק סטריליים	Terumo אירופה		20 או 50 מ"ל
אזמל	סוואן-מורטון	510	0.22 מיקרומטר
מברשת
שקופיות מיקרוסקופ	RS, צרפת
כיסויי זכוכית	RS, צרפת		76 מ"מ x 26 מ"מ x 1.1 מ"מ
מגבי רקמות Kimtech Sciences	קימברלי-קלארק פרופשיונל	5511	22 מ"מ x 22 מ"מ
מיקרוסקופ דו-עיני