כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת תרבית פרוסות
- הכינו תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות של עכברים לאחר הלידה בני 6 עד 7 ימים משני המינים.
- הכינו מדיית דיסקציה לתרבית פרוסות אורגנוטיפית המורכבת (במ"מ): 238 סוכרוז, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ו-11 גלוקוז במים נטולי יונים, ואז גז עם 5% CO2/95% O2 עד pH של 7.4.
- הכינו מצע תרבית פרוסה אורגני המורכב מ: 78.8% (v/v) מינימום חיוני נשר בינוני, 20% (v/v) סרום סוסים, 17.9 mM NaHCO3, 26.6 mM גלוקוז, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, אינסולין (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו 0.06 mM חומצה אסקורבית, pH מותאם ל 7.3. התאימו את האוסמולריות לאוסמולריות 310–330 באמצעות אוסמומטר.
- נתחו את ההיפוקמפוס מכל המוח באמצעות שתי מרית, וחתכו (400 מיקרומטר) באמצעות מסוק רקמות. מפרידים את הפרוסות באמצעות שני מלקחיים ומעבירים לתוספות תרבית תאים בקוטר 30 מ"מ בצלחת בת 6 בארות מלאה במצע תרבית (950 מיקרוליטר) מתחת לתוספות.
- אחסנו תרביות פרוסות אורגנוטיפיות באינקובטור תרביות רקמה (35°C, 5% CO2) והחליפו את מדיית תרביות הפרוסה כל יומיים.
2. הכנת פלסמיד
- הכינו את הפלסמיד לגן המעניין.
- תת-שיבוט גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) לווקטור pCAG.
- לטהר פלסמיד pCAG-EGFP עם ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין ולהמיס בתמיסה פנימית המורכבת ממים המטופלים בדיאתיל פירוקרבונט המכילים 140 mM K-מתאן-סולפונט, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 ו-10 mM HEPES, מותאם ל-pH 7.3 עם KOH (ריכוז פלסמיד: 0.1 מיקרוגרם/μL).
3. הכנת פיפטה מזכוכית
- משוך פיפטות זכוכית בורוסיליקט (4.5-8 MΩ) על מושך מיקרופיפטה (איור 1A).
הערה: פיפטות הזכוכית המשמשות להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים אידיאליות להתחשמלות.
- אופים פיפטות זכוכית למשך הלילה בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס לסטריליזציה.
- בדוק את גודל קצה הפיפטה תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי להעריך בקירוב את ההתנגדות החשמלית.
- אופציונלי: אמת את התנגדות פיפטה על ידי הצמדת פיפטה לאלקטרודת האלקטרופורציה והשתמש במיקרומניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה לנוזל מוחי מלאכותי מעוקר מסנן (aCSF) המכיל (ב- mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ו- 11 גלוקוז במים נטולי יונים, גזים עם 5% CO2/95% O2ל-pH של 7.4. אשר את ההתנגדות בפועל באמצעות הקריאה ב- electroporator.
הערה: ככל שקצה הפיפטה חד יותר, כך ההתנגדות החשמלית גדולה יותר. התנגדות פיפטה צריך להיות מתחת 10 MΩ. פיפטות זכוכית עם עמידות גבוהה לפיפטה (איור 1B) נסתמות לעתים קרובות בקצה במהלך התחשמלות חוזרת.
4. הגדרת מתקן אלקטרופורציה
- התקן את האלקטרופורטור למתקן אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטי של התא כולו, המצויד במיקרוסקופ זקוף המורכב על שולחן משתנה עם מיקרומניפולטור ומשאבה פריסטלטית.
- התקן את הראש של האלקטרופורטור על מיקרומניפולטור וחבר זוג רמקולים לאלקטרופורטור. חבר את האלקטרופורטור לדוושת רגל שניתן להשתמש בה כדי לשלוח פולס כאשר הוא מוכן.
הערה: הרמקולים פולטים צליל כאשר הם מופעלים, המהווה אינדיקטור להתנגדות החשמלית באלקטרודה. זה מאפשר לקבוע שינויים יחסיים בהתנגדות מבלי להסיט את תשומת הלב מההליך.
5. הכנת אלקטרופורציה
- מעבירים את תוספות תרבית הפרוסות מצלחות 6 בארות לצלחות פטרי בקוטר 3 ס"מ עמוסות במצעי תרבית 900 מיקרוליטר ומאחסנים באינקובטור CO2 שולחני עד שהן מוכנות לביצוע התחשמלות.
- יש לדגור מראש על תוספות תרבית טריות עם מצע תרבית פרוסה (1 מ"ל) למשך 30 דקות לפחות בכלי פטרי בקוטר 3.5 ס"מ לפרוסות תרבית לאחר התחשמלות.
- נקו והכינו את האסדה להתחשמלות.
- יש לערבב את הקווים עם 10% אקונומיקה למשך 5 דקות כדי לעקר את הצינורית והחדר לפני תחילת הניסוי ליום.
- יש לערבב את הקווים במים נטולי יונים, למשך 30 דקות לפחות, כדי לשטוף לחלוטין.
- לערבב את הקווים עם aCSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 mM tetrodotoxin (TTX).
הערה: TTX ממזער רעילות תאית ומוות כתוצאה מעירור יתר של נוירונים פנימיים.
- הגדר את פרמטרי הדופק של האלקטרופורטור: משרעת של -5 V, פולס מרובע, רכבת של 500 מילישניות, תדר של 50 הרץ ורוחב פולס של 500 מיקרוגרם.
- ממלאים פיפטה זכוכית עם 5 μL של תמיסה פנימית המכילה פלסמיד.
- הסר בועות אוויר כלואות מקצה פיפטה על ידי תנועה והקשה עדינה על הקצה מספר פעמים.
- בדוק את הקצה עבור נזק על ידי הדמיה אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציה או על ידי חזרה על שלב 3.3.1 כדי לבדוק את עמידות פיפטה.
הערה: אם החוד פגום, יש להשליך את פיפטת הזכוכית, ויש לחזור על שלב זה עם פיפטת זכוכית חדשה שהוכנה קודם לכן בשלב 3.
- חבר היטב את קצה פיפטה לאלקטרודה והפעל את הרמקולים. רשום את הקריאה (התנגדות הפיפטה) של האלקטרופורטור כאשר הקצה יצר מגע עם מדיום aCSF.
- חותכים את התרבית, מכניסים את הממברנה בעזרת להב חד ומבודדים תרבית פרוסה אחת. מעבירים בזהירות את תרבית הפרוסה לתא האלקטרופורציה באמצעות מלקחיים זוויתיים חדים ומקבעים את מיקומה בעזרת עוגן פרוסה.
- אין לשמור את תרבית הפרוסה מחוץ לאינקובטור למשך יותר מ-30 דקות בכל פעם כדי למנוע תופעות לוואי כגון שינויים בבריאות או בתפקוד העצבי.
6. אלקטרופורטים תאים מעניינים
- הפעל לחץ חיובי על פיפטה עם הפה או באמצעות מזרק 1 מ"ל (0.2-0.5 מ"ל לחץ) מחובר הצינור.
- השתמש בפקדי הידית התלת-ממדיים של המיקרומניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה קרוב לפני השטח של תרבית הפרוסה.
- בחרו תא מטרה והתקרבו אליו, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד להיווצרות גומה על פני התא, הנראית במיקרוסקופ.
- בצע מחזורי לחץ.
- הפעל במהירות לחץ שלילי קל דרך הפה, כך שנוצר אטם רופף בין קצה פיפטה לבין קרום הפלזמה, מסומן חזותית על ידי הממברנה עולה לתוך קצה פיפטה קצת. שימו לב לעלייה (~פי 2.5 מההתנגדות הראשונית) בהתנגדות פיפטה על ידי האזנה לעלייה בטון המגיע מהרמקולים. הפעילו מחדש במהירות לחץ חיובי כך שהגומה תיווצר מחדש.
- השלם מיד לפחות שני מחזורי לחץ נוספים ללא השהיה, ולאחר מכן החזק לחץ שלילי למשך 1 s.
הערה: הפסקה בין מחזורים, הפעלת לחץ רב מדי או החזקת הלחץ השלילי למשך זמן רב מדי עלולים לגרום נזק משמעותי לתאים ואולי לגרום לתא למות במהלך התחשמלות.
- הפעל במהירות את האלקטרופורטור פעם אחת באמצעות דוושת הרגל כאשר הצליל מהרמקולים מגיע לשיא יציב בגובה הצליל, המציין התנגדות חשמלית שיא. אין להמתין בשיא ההתנגדות יותר משנייה אחת לפני שליחת הדופק.
הערה: לא ראינו אלקטרופורציה מחוץ למטרה בעת שימוש בפרוטוקול זה. רק התאים שבאו במגע עם פיפטת הזכוכית במהלך מחזורי לחץ נדבקו. מיקום הפיפטה ליד תאי עצב אחרים אינו גורם להתמרה גנטית.
- משכו בעדינות את הפיפטה כ-100 מיקרומטר מהתא מבלי להפעיל לחץ.
- הפעל מחדש לחץ חיובי, ודא שההתנגדות דומה לקריאה המוקלטת בשלב 5.5, ולאחר מכן התקרב לתא הבא.
- הסר סתימות פוטנציאליות, המסומנות חזותית או על ידי התנגדות פיפטה מוגברת משמעותית (>15% יותר) לאחר אלקטרופורציה, על ידי הפעלת לחץ חיובי.
הערה: אם אין סתימה נראית לעין וההתנגדות עדיין גבוהה משמעותית, השליכו את פיפטה והשתמשו בחדשה. בממוצע, פיפטה יכולה לשמש עד 20 אירועי אלקטרופורציה אם המשתמש זהיר.
לאחר ההתחשמלות, מעבירים את תרבית הפרוסה לתוספת תרבית טרייה, ודגרים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס באינקובטור עד 3 ימים.
