מאמר שיטה

בידוד נוירונים בחוט השדרה: הליך שיפוע צפיפות לבידוד נוירונים בעמוד השדרה בילודים למחקרי מבחנה

22 בדצמבר 2025

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[הכנס FIGURE1 כאן]

איור 1: עמוד השדרה מנותח וחוט השדרה שוחרר מעכבר יילוד בן 3 ימים. החץ ב-(a) מצביע לכיוון הקצה הקאודלי של עמוד השדרה, שם מוחדרת מחט כדי לשחרר את חוט השדרה. חוט שדרה משוחרר (b) מוצג שקוע ב-PBS.

[הכנס FIGURE2 כאן]

איור 2: שיפוע צפיפות, עם תוספת תאים לאחר צנטריפוגה. השכבות מתוארות ומומחישות טוב יותר על תיאור הקריקטורה. השכבה השטחית ביותר (0) היא בדרך כלל פסולת מרקמת חוט השדרה. שכבה 1 עשירה באוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים. שכבות 2 ו-3 מכילות את רוב תאי העצב. בעוד שכבה 3 מכילה תאי עצב עם הטוהר הגבוה ביותר, כמה תאים תומכים (כלומר, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים) נמצאים בשכבה 2. הגלולה בתחתית מכילה בעיקר תאי מיקרוגליה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Eldeiry, M. et al. בידוד ותרבית של נוירוני חוט השדרה מעכברים ילודים. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד נוירונים בעמוד השדרה מעכבר יילודים לצורך מחקרי מבחנה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. קצירת חוטי שדרה

הערה: כל המכשירים צריכים להיות autoclaved (135 ° C ו 30 psi עבור 4 x 7 דקות מחזורים) עבור סטריליות.

  1. הרדימו גורי עכברים C57BL/6 בני 1-3 ימים בתא עם איזופלורן. המתן 30 שניות לאחר הפסקת התנועה וצבט את הרגל כדי לאשר חוסר תגובה.
  2. להפריד את הראש מהגוף באמצעות מספריים, עם גור במצב נוטה.
  3. ייצב את הרגליים האחוריות או הזנב והזרועות על שולחן הפרוצדורות, כאשר הצד הגבי פונה למשתמש.
  4. חותכים את העור באמצעות מספריים קשתית מעוקלת.
  5. חתכו את חוט השדרה מאזור המותני ממש מעל הירכיים והמשיכו לחתוך את שני צידי בית החזה כדי להפריד אותו מהגוף.
    הערה: זה דורש דיסקציה זהירה של חוט השדרה מאיברי הקרביים כדי למנוע נזק לא מכוון לאיברים אחרים (איור 1a).
  6. יש לשטוף ברצף במשך 10 שניות בכלי פטרי בגודל 3X10 ס"מ המכילים 5 מ"ל של 0.2 מיקרומטר של מלח חוצץ פוספט מעוקר במסנן (PBS) כדי להסיר עודפי רקמה.
  7. הכניסו מחט 22G ומזרק מלאים ב-5 מ"ל של PBS מעוקר במסנן לקצה הקאודלי של עמוד השדרה ושטפו באופן גולגולתי, מה שמאפשר לחוט לצאת לתוך צלחת פטרי רביעית (איור 1b).
  8. אסוף את חוט השדרה בצינור של 15 מ"ל עם 5 מ"ל של HABG (טבלה 1) על קרח. השתמש בזהירות כדי למנוע ריסוק חוט השדרה.
  9. חזור על שלבים 1.1-1.8 עבור כל גור בהמלטה.
    הערה: באופן אידיאלי, תהליך זה אמור להימשך פחות מ -30 דקות לכל חוט שדרה כדי להבטיח בידוד נוירונים בריא.

2. בידוד תאי עצב

הערה: יש לבצע את השלב הבא במכסה מנוע זרימה למינרית. צפויה היכרות עם טכניקה סטרילית בסיסית.

  1. טחינת רקמות
    1. קח את הצינור המכיל את חוט השדרה ונער קלות כדי להשעות את הרקמה.
    2. יוצקים רקמות מהצינור לתוך צלחת פטרי זכוכית 60 מ"מ וקוביות עם סכין גילוח כדי ליצור חתיכות עדינות ~ 0.5 מ"מ בגודל.
    3. מעבירים את הרקמה עם פיפטה רחבה לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של HABG.
    4. הכניסו אותו לאמבט מים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאזן בטמפרטורה זו. שמור את התאים על שייקר בדיוק מספיק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל.
      הערה: שלב זה נעשה כדי למנוע זעזוע התאים עם העברתם מקרח למדיום העיכול. שמירה על התאים ב 30 ° C מסייעת להפחית מוות תאים הקשורים מטבוליזם מוגבר אחרת ב 37 ° C.
  2. הכינו את אמצעי העיכול (טבלה 1).
  3. הכינו את שיפוע הצפיפות (טבלה 1).
    1. הכינו כל אחת מ-4 השכבות ב-4 צינורות נפרדים של 15 מ"ל, כמתואר בטבלה 1.
    2. הוסף 1 מ"ל מכל שכבה לצינור חדש של 15 מ"ל. התחילו עם שכבה 1 בתחתית והוסיפו ברצף עד שתגיעו לשכבה 4 למעלה. הימנעו מהפרעה לשכבות בזמן ההוספה.
  4. שטפו את הצלחות מצופות ה-PDL. יש לשטוף במים סטריליים למשך מספר דקות לפני הסרת המים שנותרו ולאפשר להם להתייבש למשך שעה.
  5. מעבירים את הרקמה למדיום העיכול.
    1. הסר את הצינור המכיל רקמות מאמבט מי השייקר ב 30 ° C ולאפשר לו לשקוע במשך כמה דקות.
    2. הסר את צינור העיכול בינוני מאמבט המים 37 מעלות צלזיוס ושאפו אותו לתוך מזרק leur-lock.
    3. יש לשאוף את עודפי ה-HABG מהצינור המכיל רקמות.
    4. השתמש במסנן leur-lock 0.2 מיקרומטר על המזרק כדי להוסיף אמצעי עיכול לצינור המכיל רקמות.
    5. הכניסו את הצינור לאמבט מים בטמפרטורה של 30°C למשך 30 דקות. השאירו את התאים רועדים מספיק כדי לאפשר להם להיות תלויים בנוזל.
      הערה: חשוב לא לשמור על התאים במדיום העיכול זמן רב מדי או לתת לטמפרטורה להיות גבוהה מדי, מה שעלול להוביל לעיכול מוגזם ולגרום לרקמה להיות תלויה בתערובת ג'לטינית.
  6. במהלך תקופה זו, מעילים את הלמינין.
  7. לבצע טריטורציה (כלומר הפרדת התאים מהרקמה).
    1. הסר את הצינור מאמבט המים הרועד של 30 מעלות צלזיוס ואפשר לו להסתפק בכמה דקות.
    2. שואפים עודף עיכול בינוני.
    3. להשעות את הרקמה ב 2 מ"ל של HABG.
    4. באמצעות פיפטה צרה, triturate 10x עבור 45 s.
      הערה: זהו כנראה הצעד הקריטי ביותר והוא יכול להקטין משמעותית את התשואה אם לא נעשה כראוי.
      1. שאפו את הרקמה לתוך פיפטה ומיד רוקנו את התוכן בחזרה.
      2. הימנע החדרת אוויר, כפי שהוא יפחית באופן משמעותי את התשואה קיימא.
        הערה: הפיפט האידיאלי הוא פיפטה מזכוכית בגודל 9 אינץ'. קצה הפיפטה צריך להיות מלוטש באש כדי להחליק משטחים גסים. לאחר מכן יש למקם אותו בתמיסה ביחס 1:20 של דיכלורודימתילסילן (DMDCS) בכלורופורם ולהשאיר O/N. לאחר מכן יש להסיר את הפיפטה ולתת לה להתייבש באוויר. לאחר מכן, זה צריך להיות autoclaved עבור עיקור.
        זהירות: DMDCS וכלורופורם דליקים מאוד, וסיליקון צריך להתבצע במכסה אדים.
    5. שאפו את 2 מ"ל הסופרנאטנט העליונים והכניסו אותם לשפופרת חדשה של 15 מ"ל שכותרתה "אוסף".
    6. חזור על שלבים 2.7.3-2.7.5 פעמיים נוספות (צינור איסוף התאים צריך להיות 6 מ"ל עד הסוף).
    7. העבר באיטיות את תכולת צינור האיסוף לצינור השיפוע שהוכן בשלב 2.2, כדי למנוע הפרעה של מעבר הצבע.
  8. בשלב זה, הסר את המדיום הנוירובזאלי שהוכן בעבר (טבלה 1) מהמקרר ואפשר לו להתחמם באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס.
  9. לטהר את הנוירונים.
    1. צנטריפוגה את צינור השיפוע למשך 15 דקות ב 800 x g ו 22 ° C.
    2. אספו את השכבות הרצויות בעזרת פיפטה (איור 2) והכניסו לצינור חדש של 15 מ"ל. עבור בידוד נוירונים בעל טוהר גבוה ביותר (כלומר >90%), לאסוף שכבה 3. לקבלת יבול רב יותר עם פחות טוהר (כלומר >70-80%), אספו שכבות 2 ו-3.
    3. דללו את שיפוע הצפיפות על ידי הוספת 5 מ"ל של HABG לשכבות החדשות שנאספו.
    4. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות ב 22 ° C.
    5. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש ב-5 מ"ל של HABG, והעבירו את הגלולה כדי להשעות את התאים.
    6. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות ב 22 ° C.
    7. להשליך את supernatant, resuspend ב 3 מ"ל של מדיום neurobasal, ו flick את הגלולה כדי להשעות מחדש את התאים.
מדיהאחסוןמרכיביםהכנה
HABG4 °C/24h100 מ"ל- הפשרה B27 במקרר 4°C O/N
- חיטוי מסנן (0.22 מיקרומטר)
תרדמת חורף א'97.8 מ"ל
B27 [2%]2 מ"ל
GlutaMAX [0.5 מילימול]0.25 מ"ל
Neurobasal Media4 °C/שבוע אחד100 מ"ל- הפשרה B27 במקרר 4°C O/N
- חיטוי מסנן (0.22 מיקרומטר)
- Aliquot 50 מ"ל מנות לתוך צינורות 50 מ"ל (לאחסן ב 4 ° C)
נוירובזל A97 מ"ל
B27 [2%]2 מ"ל
GlutaMAX [0.5 מילימול]0.25 מ"ל
עט/סטרפ [1%]1 מ"ל
Digestion Mediaיום הבידוד10 מ"ל- נער נמרצות
- תנו לו לשבת באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (רצוי להכין 30 דקות לפני השימוש)
- חיטוי מסנן (0.22 מיקרומטר)
ה-כא10 מ"ל
פפאין25 מ"ג
GlutaMAX [0.5 מילימול]0.025 מ"ל
שיפוע צפיפותיום הבידוד1 שיפוע
LayerOptiPrepחבג
(0.13 מ"ל)(5.29 מ"ל)
1 תחתית0.26 מ"ל1.24 מ"ל
20.19 מ"ל1.31 מ"ל
30.15 מ"ל1.35 מ"ל
4 למעלה0.11 מ"ל1.39 מ"ל

טבלה 1: הכנת המדיה והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: עמוד השדרה מנותח וחוט השדרה שוחרר מעכבר יילוד בן 3 ימים. החץ ב-(a) מצביע לכיוון הקצה הקאודלי של עמוד השדרה, שם מוחדרת מחט כדי לשחרר את חוט השדרה. חוט שדרה משוחרר (b) מוצג שקוע ב-PBS.

figure-results-2
איור 2: שיפוע צפיפו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצב שינה A בינוני - 500 מ"לתרמו-פישרA1247501https://www.thermofisher.com/ הזמנה/קטלוג/מוצר/A1247501
תרדמת חורף A מינוס סידן - 500 מ"לחתיכות מוחה-כאhttp://www.brainbitsllc.com/ תרדמה-מינוס-סידן/
גלוטמקס 100X - 100 מ"לתרמו-פישר35050061https://www.thermofisher.com/ הזמנה/קטלוג/מוצר/35050079
תוסף B27 50X - 10 מ"לתרמו-פישר17504044https://www.thermofisher.com/ order/catalog/product/17504044
פפאין, Lyophilized - 100 מ"גוורטינגטוןLS003119http://www.worthington- biochem.com/pap/cat.html
נוירובזל A בינוני - 500 מ"לתרמו-פישר10888022https://www.thermofisher.com/ הזמנה/קטלוג/מוצר/10888022
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U / מ"ל)תרמו-פישר15140122https://www.thermofisher.com/ הזמנה/קטלוג/מוצר/15140122
פולי-די-ליזין (PDL) הידרוברומיד- 5 מ"גסיגמא-אולדריץ'P6407-5MGhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/p6407? lang=en®ion=US
למינין עכבר - 1 מ"גתרמו-פישר23017015https://www.thermofisher.com/ הזמנה/קטלוג/מוצר/23017015
טריפאן כחול - 20 מ"לסיגמא-אולדריץ'T8154-20MLhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/t8154? lang=en®ion=US
OptiPrep צפיפות הדרגתית בינונית-250 מ"לסיגמא-אולדריץ'D1556-250MLhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/d1556? lang=en®ion=US
Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)סיגמא-אולדריץ'440272-100 מ"לhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/440272? lang=en®ion=US
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'288306-1Lhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sial/288306? lang=en®ion=US
זכוכית פיפט - 9"סיגמא-אולדריץ'13-678-20גhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/cls7095d9? lang=en®ion=US
נורת פיפטה - 5 מ"לסיגמא-אולדריץ'Z186678-3EAhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/z186678? lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-
_-prodRecCold_xviews-_- prodRecCold10-1
צלחת פטרי מותג, זכוכית - 60X15 מ"מ®סיגמא-אולדריץ'BR455717-10EAhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/br455717? lang=en®ion=US
צלחת סטרילית לתרבית תאים עם 24 בארותסיגמא-אולדריץ'M8812-100EAhttp://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/m8812? lang=en®ion=US

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Spinal Cord NeuronsDensity GradientNeuron IsolationTissue DigestionTrituration ProcedureCentrifugation ProtocolLayer CollectionCell SuspensionNeuronal MediumHABG Solution

מאמרים קשורים