Decellularization קומפלקס לב ריאה: טכניקה עבור decellularizing הלב והריאות מ מודל Murine

Abstract

מקור: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים שיטה לייצור מטריצה חוץ-תאית דה-תאית או פיגומים ECM על ידי יישום זילוח מקדים של דטרגנטים דרך כלי הדם. לאחר מכן ניתן להשתמש בפיגומי ECM המבניים כדי לנתח עיצוב מחדש של ECM הקשור למחלת לב-ריאה.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מיקרו-כירורגיה לאחר המוות

1. הרדימו את העכבר באמצעות תא CO₂.
   1. הכניסו את העכבר לתא של 4 ליטר, והתחילו למלא ב-100% CO₂, החל מ-0.2 ליטר/דקה למשך 2 דקות, והגדילו עד שהגיעו לזרימה של 0.8 ליטר/דקה אחרי 3 דקות. העכבר צריך לאבד את ההכרה במהלך 2 הדקות הראשונות, ואז הנשימה צריכה להפסיק (בדרך כלל בסביבות 5 דקות, אבל זרימה ניתן לשמור לפי הצורך). אשר את המוות לפני שתמשיך לשלב הבא.
2. לגלח את בית החזה, הבטן והגב של העכבר עם קוצץ השיער ולחטא עם אתנול 70%. גילוח מפחית מאוד את מספר הממצאים בשל נוכחות שיער או על דגימות להדמיה או ניתוח ביוכימי.
3. הצמד את העכבר למגש פוליסטירן, האריך את גפיו הקדמיות והאחוריות, כמו גם את ראשו וזנבו. הניחו אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרוכירורגיה.
4. באמצעות מספריים בתבנית מאיו ישרה יוצרים גישה כירורגית עם חתך עורי העובר מהאזור התת לסתי לבטן התחתונה ומנתחים תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה והצפק.
5. בעזרת מספריים מיקרוכירורגיים, חותכים את שרירי החזה מז'ור ואת שרירי החזה הקטנים לאורך החלל הבין-קוסטלי השישי משני צידי דופן בית החזה.
6. בעזרת מספריים בתבנית ישרה, חותכים את עצם החזה לאורך החתכים הקודמים, ולאחר מכן משלימים עצם החזה על ידי חיתוך עצם החזה לאורך צירו הארוך, ואז מרימים ומצמידים את שני צידי דופן בית החזה כדי לחשוף את קומפלקס הלב ריאה.
7. באמצעות מיקרו-מלקחיים עגולים (או מיקרו-מלקחיים של Dumont), מסירים את בלוטת התימוס ואת רקמת השומן שמסביב על-ידי משיכה עדינה שלהם מחיבוריהם. זה יחשוף את כלי השיט העיקריים.
8. באמצעות הצריבה, לצרוב את וריד הקאווה היורד, באמצעות מספריים דפוס ישר, לחתוך את הוושט.
9. באמצעות מיקרו-מלקחיים חדים, להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת brachiocephalic, קרוטיד משותף שמאל ועורקים subclavian שמאל מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצריבה.
10. באמצעות מחזיק מיקרו-מחט, מיקרו-מלקחיים חדים ותפר 9-0 מניחים תפרים מעל הופעתם של העורקים הברכיוצפליים, קרוטיד משותף שמאלי ועורקים תת-קרקעיים שמאליים.
11. לצרוב את הוורידים brachiocephalic.
12. הפרידו את בלוטות הרוק התת לסתיות לאורך קו האמצע כדי לחשוף את שרירי הצוואר ואת קנה הנשימה. להפריד את השרירים כדי לחשוף את הרצועה cricothyroid. באמצעות מיקרו מספריים, לפתוח פתח על ידי חתך הרצועה.
13. מכניסים קטטר 27 גרם לקנה הנשימה ודוחפים בעדינות עד שקנה הנשימה מסתעף לתוך הסמפונות (כלומר, עד להתנגדות לצנתר, ואז נסוגים 3 מ"מ). היזהר לא להפריע הסמפונות. באמצעות תפר 6-0, מניחים 3 תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.
14. חתך את העכבר בגובה החוליה ה -12 בבית החזה. אבי העורקים היורד עובר קדמית לעמוד השדרה ויש לחתוך אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. הפרידו את החצי התחתון זה מזה.
15. צנתור לאחור של אבי העורקים ודוחף את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת אבי העורקים. באמצעות תפר 9-0 מניחים 4 תפרים סביב אבי העורקים, החל מ-5 מ"מ מתחת לקצה הצנתר.

2. דה-צלולריזציה

1. חבר את העכבר למערכת משאבות באמצעות צינורות סיליקון ומחברי Luer. יש לערבב עם מים שעברו דה-יוניזציה בטמפרטורה של 200 מיקרוליטר/דקה למשך 15 דקות. שמור על קצב זרימה זה במהלך דה-צלולריזציה.
2. החליפו את חומר הזילוח ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט (DOC) מדולל במים שעברו דה-יוניזציה ולמשך הלילה.
3. החליפו את חומר הזילוח ל-0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS) מדולל במים נטולי יונים, ולמשך 8 שעות.
4. יש לערבב עם מים נטולי יונים, למשך הלילה, כדי לשטוף SDS ו-DOC למשך 24 שעות.
5. כנסו את הלב והריאות שעברו דה-צלולריזציה על ידי חתך החיבורים שלהם לבית החזה באמצעות מספריים מעוקלים ואחסנו בצינור קריו-סטרילי עם מים נטולי יונים, עם 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.3 מיקרומטר נתרן אזיד ב-4°C. ניתן לאחסן פיגומים ECM למשך 12 שבועות לפחות. אם הפיגום ישמש לאנליזה ביוכימית (למשל, ספקטרומטריית מסות), יש להקפיא בחנקן נוזלי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוכירורגיה
תפר 6-0, מחט חתך משולש (Vicryl)	אתיקון	6301124
9-0 מיקרו-תפר (Safil)	בי בראון	G1048611
מלקחיים אדסון	כלים מדעיים משובחים	11006-12
אדסון מלקחיים עם שיניים	כלים מדעיים משובחים	11027-12
מחזיק מיקרו-מחט Castroviejo	כלים מדעיים משובחים	12061-01
תא אוורור CO2 להמתת חסד של עכבר
מים שעברו דה-יוניזציה (Milli-Q IQ 7000, מערכת מים אולטרה-טהורה במעבדה)	מרק	ZIQ7000T0
מגש פוליסטירן חד פעמי (~ 30 × 50 ס"מ)
מיקרוסקופ דיסקציה (Greenough, עם צוואר אווז בעל שתי זרועות)	לייקה	S6 D
מיקרו-מרית דו-צדדית	כלים מדעיים משובחים	10091-12
מיקרו-מלקחיים Dumont (שניים)	כלים מדעיים משובחים	11252-20
מיקרו-מלקחיים של Dumont עם קצוות של 45°	כלים מדעיים משובחים	11251-35
גוזז שיער	אוסטר	76998-320-051
מחזיק מחט Halsey (עם לסתות טונגסטן קרביד)	כלים מדעיים משובחים	12500-12
צנתר תוך ורידי 24 מד (Insyte)	ב.ד.	381512
צנתר תוך ורידי 26 מד (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
מספריים מאיו (גזירה קשה, ישרה)	כלים מדעיים משובחים	14110-15
מיקרו-מלקחיים עם קצוות טבעתיים	אסקולאפ	FM571R
מספריים מיקרו-קפיציים (Vannas, מעוקלים)	כלים מדעיים משובחים	15001-08
מחטים (27 מד; מיקרולנס)	ב.ד.	21018
מגבת נייר (סטרילית) או מפית כירורגית
מספריים משוננים (CeramaCut, ישר)	כלים מדעיים משובחים	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	אסקולאפ	OL166R
מזרקים (1 מ"ל; פלסטיפק)	ב.ד.	3021001
מזרקים (10 מ"ל; פלסטיפק)	ב.ד.	3021110
מספריים לגיד (וולטון)	כלים מדעיים משובחים	14077-09
דה-סלולריזציה
70% אתנול (אלכוהול מוחלט 99.9%); יש להתאים את האלכוהול האבסולוטי ל-70% (vol/vol) באמצעות מים שעברו דה-יוניזציה	שזיף	1680766
מים שעברו דה-יוניזציה (Milli-Q IQ 7000, מערכת מים אולטרה-טהורה במעבדה)	מרק	ZIQ7000T0
אביזרי Luer ל-Tubing לגברים (1/8 אינץ')	מכשירים מדויקים בעולם	13158-100
אביזרי Luer ל-Tubing לגברים (1/8 אינץ')	מכשירים מדויקים בעולם	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	תרמו פישר סיינטיפיק	70011044
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15140122
משאבה פריסטלטית (עם 12 ערוצים)	אולה דיץ'	110AC(R)20G75
צינורות סיליקון (עם תעודת זהות 2 מ"מ ו-4 מ"מ o.d.)	אולה דיץ'	31399
נתרן אזיד	סיגמא-אולדריץ'	08591-1ML-F
נתרן דאוקסיכולאט (DOC)	סיגמא-אולדריץ'	D6750-100G