בידוד אפיתל פפילה היקפית (CVP) ממודל עכבר: הליך אנזימטי להפרדת אפיתל CVP מלשון עכבר

תקציר

מקור: שכטמן, L. A. et al. דור ותרבות של אורגנואידים לשוניים שמקורם בתאי גזע של טעם עכבר בוגר. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מתארים את הבידוד של אפיתל פפילות היקפיות (CVP) מלשון מורין.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד אפיתל CVP

1. הרדימו את העכברים עם חנק_CO2 בהתאם לתקנות IACUC, ולאחר מכן שיטה משנית מאושרת כגון בית החזה דו-צדדי, פריקת צוואר הרחם, עריפת ראשים או כריתה.
2. השתמש מספריים סטריליים גדולים לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. הרימו את הלשון וחתכו את הפרנולום הלשוני כדי להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה. גזרו את הלשון ואספו אותה במי מלח סטריליים קרים כקרח של Dulbecco (dPBS) עם Ca²⁺ ו- Mg²⁺.
3. הסירו והשליכו את הלשון הקדמית על-ידי חיתוך החלק הקדמי של הבולטות הבין-טוחנת בעזרת סכין גילוח (איור 1A, קו מקווקו). השתמשו במגבון עדין כדי להסיר שיער ונוזלים עודפים מהלשון האחורית.
4. מלאו מזרק 1 מ"ל ב-200-300 מיקרוליטר של תמיסת אנזימי הזרקה (ריכוז סופי: 2 מ"ג/מ"ל סוג I Collagenase ו-5 מ"ג/מ"ל Dispase II ב-Ca²⁺/Mg²⁺-containing dPBS, מדולל מתמיסות מלאי של 10 מ"ג/מ"ל) והכנס מחט בגודל 30 G x 1/2 ממש מעל הבולטות הבין-מולרית (איור 1B, חץ שחור) עד שהוא ממש קדמי ל-CVP (איור 1B, קופסה שחורה). יש להזריק את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות הצדדיים של ה-CVP בין האפיתל לבין הרקמות שמתחתיו (lamina propria, שריר). משוך את המזרק לאט וברציפות מהלשון בעת ביצוע ההזרקה.
5. לדגור על הלשון בסטרילי Ca²⁺/Mg^2+-free dPBS בטמפרטורת החדר למשך 33 דקות בדיוק.
6. בצע חתכים קטנים באפיתל דו צדדי ורק קדמי ל- CVP באמצעות מספריים דיסקציה עדינים במיוחד, וקלף בעדינות את האפיתל על ידי הרמת אותו עם מלקחיים עדינים. ברגע שאפיתל התעלה נקי מרקמת החיבור הבסיסית, הניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 2 מ"ל המצופה מראש ב- FBS. בצעו את חיתוך האפיתל לפני או אחרי ניתוק אפיתל CVP (איור 1C, D).

תוצאות

איור 1: לשון מנותחת ואפיתל CVP קלוף. (A) הלשון מנותחת, והלשון הקדמית מוסרת על ידי חיתוך רק החלק הקדמי של הבולטות הבין-מולרית (קו מקווקו), ועוזבת את הלשון האחורית, הכוללת את ה-CVP (קופסה שחורה) (B) מחט מוחדרת רק קדמית לבולטות הבין-טוחנת (חץ שחור), ותערובת אנזימים מוזרקת מתחת ולקצוות הרוחביים של ה-CVP (קופסה שחורה). (C) אפיתל קלוף לא גז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרק TB	מזרק BD	309659
פוספט חוצץ מלוחים עם Ca²⁺ & Mg²⁺	גיבקו	10010-023
פוספט חוצץ מלוחים עם Ca²⁺ & Mg²⁺	סיגמא מדעי החיים	D8662-500ML
Dumont #5 מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11252-30
סרום בקר עוברי (FBS)	גיבקו	26140-079
1 מ"ל מזרק TB	מזרק BD	309659
2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות	ארה"ב סיינטיפיק	1420-2700
מספריים כירורגיים - שארפ	כלים מדעיים משובחים	14002-14
מספריים דקים במיוחד של בון	כלים מדעיים משובחים	14084-08
טיימר/סטופר בעל ספרות גדולות	פישר סיינטיפיק	S407992
סטריאומיקרוסקופ	זיס	סטמי SV6
מספריים אביביות של כהן-ונס	כלים מדעיים משובחים	15000-02
Collagenase מ Clostridium histolyticum, סוג I	סיגמא מדעי החיים	C0130-1G
Dispase II (פרוטאז נייטרלי, דרגה II)	סיגמא-אולדריץ' (רוש)	4942078001