$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת מיקרו-בועות
- הכנת מיקרו-בועות להזרקה
הערה: העוזר מבצע שלב זה כאשר "הזרקת מיקרו-בועות (MB) לעוברים" מתחילה. כל עובר מוזרק פעם אחת, כאשר סוג המיקרו-בועות שנבחר עבור כל זריקה ייבחר באופן אקראי על ידי העוזר כך שכל סוגי המיקרו-בועות מפוזרים באופן שווה לאורך ההליך אך ניתנים בסדר אקראי. ודא שהמנתח עיוור לסוג הבועה המוזרקת.
- קבע את נפח תמיסת בועות המניות הדרוש לייצור ריכוז סופי של 1 x 108 MB/mL בנפח של 400 μL (חשב את הנפח באמצעות ריכוזי המלאי). Aliquot את נפח המלח המתאים לתוך צינור microcentrifuge ריק.
- עצבן בעדינות את בקבוקון המיקרו-בועות שנבחר וצייר נפח עודף (~ 50 μL גדול מזה שחושב לעיל) של התמיסה לתוך מזרק 1 מ"ל באמצעות מחט 21 גרם. הזריקו את המיקרו-בועות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ריק.
- פיפטה את הנפח הדרוש של פתרון מלאי microbubble ולהוסיף aliquot של מלוחים. מערבבים על ידי ערבוב עדין עם קצה הפיפטה.
- ציירו את תמיסת המיקרו-בועות המדוללת לתוך מזרק נקי באמצעות מחט 21 גרם. הסרת המחט, לחסל כל בועות אוויר מן המזרק לצרף את luer ואת הצינור. דחפו באיטיות את התמיסה לקצה הצינור והקפידו שלא ליצור בועות אוויר.
- הכנס את המזרק למשאבת עירוי מזרקים כדי לפזר את המיקרו-בועות בקצב של 20 מיקרוליטר/דקה לנפח כולל של 20 μL. חבר מחט זכוכית משוכה לקצה הצינור. קרבו את המשאבה לשלב ההזרקה.
2. הזרקת מיקרו-בועות לעוברים
- בחרו והוציאו באופן אקראי (עם כף מחוררת) עובר אחד מצלחת המדיה המצוננת. מניחים בכלי דיסקציה הממוקם על במת האולטרסאונד מתחת לסטריאוסקופ ומוציאים את שק החלמון ואת קרומי השפיר בעזרת המלקחיים העדינים, חותכים/קורעים מהצד שנראה הכי פחות וסקולרי (הצד האנטימי). זה מושג בקלות רבה ביותר על ידי פירסינג באזור הסמוך לאזור הראש.
- חותכים מספיק כדי להוציא את העובר מבפנים, אבל לא יותר. ייצבו את כלי הדיסקציה באמצעות חתיכות קטנות של פלסטלינה.
- תמרנו בעדינות את השק מסביב לעובר. מקם את העובר על צדו, עם השליה וכלי הטבור מלפנים. בעזרת סיכות החרק, נעצו את שק החלמון (מומלץ 4 פינים) ואת שולי השליה לפי הצורך כדי להצמיד אותם למקומם. הימנע כלי שיט גדולים.
- שטפו את העובר עם PBS שחומם מראש בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס עד שהעובר יתחדש. זהה את וריד הטבור ואת רשת כלי הדם הקשורים אליו. מקמו את המנה כך שניתן יהיה לבצע את ההזרקה בנוחות.
הערה: לאחר חימום, הדם בעובר יתחיל לזרום, שאיבה גלויה בעורק הטבור. כאשר הזרימה מתחילה לראשונה, הוורידים יהיו אדומים בוהקים, כאשר הדם בשני כלי הדם נראה במהירות זהה. הענפים הנובעים מווריד הטבור מכסים בדרך כלל את אלה מעורק הטבור על פני השליה.
- לאחר שהעובר קם לתחייה, כסו אותו (אך לא את השליה) בג'ל אמריקאי שחומם מראש, והקפידו להסיר בעדינות את כל בועות האוויר (באמצעות המלקחיים העדינות) מרחבי העובר. קשטו את המנה ב-PBS שחומם מראש.
הערה: שימו לב לרמת התמיסה במזרקי PBS וג'ל והוסיפו מזרקי גיבוי לכוס החימום לפי הצורך.
- הרכיבו את מחט הזכוכית על כדור פלסטלינה גדול בקצה צלחת הדיסקציה והכניסו את קצה המחט לתוך PBS. בחירת וריד על פני השטח הכוריוני של דיסק השליה, רחוק מהענף הראשי ככל האפשר, לקצץ את הקצה לגודל באמצעות מספריים. ההזרקה היא הקלה ביותר אם הקצה נחתך בזווית קלה. הסירו את הקצוות המשוננים של הזכוכית בעזרת קצה מספריים הקפיץ.
- באמצעות משאבת המזרק, הזריקו באיטיות את תמיסת המיקרו-בועות במהירות של 20 מיקרוליטר/דקה לתוך מחט הזכוכית עד שכל האוויר נפלט מקצה המחט וניתן לראות מיקרו-בועות זורמות בחופשיות לתוך PBS. עצור את המשאבה והתאפס לנפח הזרקה של 20 μL. אין לאפשר כניסת אוויר למערכת כלי הדם של העובר במהלך ההזרקה.
- הכנס את קצה מחט הזכוכית בעדינות לאחד הוורידים בשליה וודא שהוא אינו נייד. הניפו את ראש הסטריאוסקופ ומקמו את המתמר מעל העובר. התחל הדמיה.