בידוד חיידקי לחמית מבוסס ספוגית: טכניקה לבידוד חיידקים קומנסליים ממודל הלחמית של מורין

תקציר

מקור: Smith-Page, K. et al. בידוד וזיהוי קומנסלי בעכברים. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מתאר טכניקה מבוססת מטוש לבידוד חיידקים קומנסליים בני קיימא מלחמית העין. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור פרופיל של המיקרוביום החיידקי הקומנסלי של הלחמית, אשר ממלא תפקיד הגנתי מפני פתוגנים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת ספוגית עיניים, הגדרת שדה עבודה, ספוגית עין עכבר והעשרת דגימות

1. הכינו מקלוני עיניים סטריליים
   הערה: מקלוני עיניים סטריליים הם קיסמים מעץ מצופים דק עם שכבה דקה של כותנה ועשויים בבית.
   1. יש לבצע אוטוקלאבים בכמות מתאימה של חבטות כותנה וקיסמים למספר העכברים שיש לספוג.
   2. צבטו חתיכת כותנה באורך חצי סנטימטר עם האגודל והאצבע. מקניטים את החבטות על ידי משיכת הקצוות עם האגודלים והאצבעות כדי ליצור שכבה נקבובית אחת שטוחה, ועוצרים ממש לפני שהמכה מתפרקת (חתיכות קטנות של כותנה המפוזרות לאורך החבטה המתוחה מקובלות).
   3. סובבו את החבטות סביב אחד הקצוות החדים של קיסם השיניים על-ידי החזקת החתיכה המתוחה בקצה הקיסם כשהוא מעוות, ראו איור 1. מקלון העיניים "השלם" יהיה בעל שכבה דקה מאוד של כותנה מתוחה על הקצה, המשתרעת במרחק של כחצי עד סנטימטר אחד מהקצה.
   4. הכניסו מקלונים "שהושלמו" לכוס קטנה, מצדו של המקלון כלפי מטה וכסו. אוטוקלאב.
2. הגדרת סביבת העבודה
   1. הכינו חומר הרדמה המכיל 2 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל), 400 מיקרוליטר קסילזין (100 מ"ג/מ"ל) ו-27.6 מ"ל מי מלח סטריליים (0.9% NaCl ב-dH₂O) בצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל. יש לסנן, לעקר ולבצע הרדמה לשימוש מיידי (ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך חודש; יש לאפשר תמיד לאיזון לטמפרטורת החדר לפני השימוש).
   2. נקו ונקו את אזור העבודה עם חומר חיטוי כדי למזער את הזיהום.
   3. Aliquot 0.5 מ"ל של מדיה סטרילית של עירוי לב המוח (BHI) לתוך מסומן 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים (1 צינור לכל עכבר ובקרה); סדרו במדף מיקרוצנטריפוגות. הניחו את המדף על קרח.
   4. הגדר זרימת עבודה באופן הבא (משמאל לימין): תחנת הרדמה עכבר (כלוב המכיל עכברי ניסוי, כלוב סטרילי ריק, הרדמה בטמפרטורת החדר, מחט 25 גרם ומזרק 1 מ"ל), תחנת ספוגית עיניים (BHI על קרח, מקלוני עיניים מעוקרים, מגבות נייר נקיות, תרסיס 70% איזופרופנול) ותחנת ציפוי (צלחות אגר דם בטמפרטורת החדר, פיפטה 10 מיקרוליטר, 10 μL טיפים חד פעמיים סטריליים, מיכל פסולת ביולוגית).
3. ספוגית עיניים
   1. יש לתת 10 μL של הרדמה לכל 1 גרם של משקל עכבר במינון של קטמין וקסילזין בהתאמה תוך צפקית לכל עכבר בוגר ולהכניס לכלוב אוטוקלאבי. בדיקת הרדמה על ידי סחיטת כרית כף רגל אחורית; אין תזוזה המעידה על הרדמה מתאימה.
   2. הקצו יד אחת לטפל רק בעכברים מורדמים ויד שנייה לטפל רק במקלון העיניים ובתרבית. עבור מטוש, להסיר את העכבר מורדם לחלוטין מן הכלוב; יש להניח על גבי משטח עבודה נקי הממוקם על צידו כשעין שמאל חשופה. יש לרסס ידיים עטויות כפפות באיזופרופנול, ולייבש במגבת נייר נקייה.
   3. Uncap מסומן במיוחד בצינור מיקרו-צנטריפוגה BHI עם יד ייעודית לטיפול במדיה. החזירו את הצינור למתלה המיקרו-צנטריפוגות על קרח. טבלו את קצה הכותנה המצופה של מקלון העין ב-BHI, משכו את מקלון העין מהצינור תוך ערבול הקצה פעמיים כנגד הצינור הפנימי כדי להסיר עודפי נוזלים.
   4. עם היד המטפלת בעכבר, החזק את העכבר בעדינות על ידי קשקוש הצוואר. ביד השנייה, הניחו את קצה משטח העין כנגד אזור הלחמית המדיאלית של עין שמאל, ראו איור 2A. לחצו קלות על גלגל העין והזיזו את המקלון בתנועת שטיפת חלונות (איור 2B) קדימה ואחורה, בין העפעף התחתון לעין, 10 פעמים. שמור על לחץ מתמיד.
   5. מבלי לגעת בפרווה, הסירו בעדינות את קצה המקלון, בניצב למקום שבו הוא הוכנס, והניחו את צמר הגפן כלפי מטה ישירות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן המכיל מדיה BHI. יש למרוח טיפת עיניים מסככת על העין המטושטשת.
   6. החזירו את העכבר לכלוב.
   7. תנו למקלון לעמוד 10 עד 15 דקות על קרח והסירו את מקלון העיניים עם היד הכפפה המעוקרת על ידי ערבוב הקצה במדיה למשך 10 סיבובים. משוך את המקלון על ידי ערבול קצה כנגד הקיר הפנימי של צינור מיקרו-צנטריפוגה למשך 5 סיבובים. יש להשליך את המקלון למיכל מסוכן ביולוגית.
   8. חזור על שלבים 1.3.2 עד 1.3.7 עבור כל עכבר ועבור דגימות ביקורת (עור או מקלון פרווה). יש לעקר את הכפפות כראוי בין כל מטוש.
4. העשרה
   1. העשירו את הדגימה על ידי דגירה סטטית של הצינור למשך שעה אחת ב-37°C
   2. במהלך הדגירה, יש לסמן טריפטיקייס סויה בטמפרטורת חדר אחת עם צלחת אגר מדם כבש 5% (צלחת TSA) לכל עכבר ולחלק לשניים.
   3. לאחר הדגירה של תרבית מטוש העין, מוציאים דגימות מועשרות מהאינקובטור ומניחים על קרח.
   4. דגימות מערבולת קצרות לערבוב ולצלחת בהתאם לסכמה באיור 3A. Aliquot 10 μL של הדגימה על צלחת TSA להטות את הצלחת כדי ליצור רצועה, לחזור על 2 פעמים.
   5. בצד השני של קו ההפרדה של הצלחת, נקודה 10 μL של דגימה על אגר, לחזור על 9 פעמים.
   6. יש לדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C למשך 18 שעות, יומיים ו-4 ימים (בתא נקי המונע התייבשות של צלחות אגר). ספירת מושבות ברצועות, רישום מורפולוגיה וחישוב יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לכל מטוש עבור מבודדים דומים מורפולוגית. התבוננו בנקודות עבור אורגניזמים ייחודיים שלא נלכדו ברצועות.

תוצאות

איור 1: מקלון עיניים פנימי.
(A) בין נקודת הקיסם הסטרילית לאצבע המורה הוחזקה פיסת כותנה דקה בקוטר של כ-1 ס"מ והקיסם גולגל תוך שמירה על לחץ קל כנגד האצבע המורה עד שהכותנה גולגלה במלואה על קצה הקיסם. (B) דוגמה למטוש עיניים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.1 עד 10 מיקרוליטר קצה פיפט	ארה"ב סיינטיפיק	1110-300	אוטוקלאבה לפני השימוש
0.5 עד 10 מיקרוליטר פיפת אפנדורף	פישר סיינטיפיק	13-690-026
1 מ"ל מזרק	פישר סיינטיפיק	BD309623	מזרק אחד לכל קבוצת מטוש עיניים
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	ארה"ב סיינטיפיק	1615-5500	אוטוקלאבה לפני השימוש
1000 μ מ"ל קצה פיפט	ארה"ב סיינטיפיק	1111-2021	אוטוקלאבה לפני השימוש
200 עד 1000 מיקרוליטר גילסון פיפטמן (P1000)	פישר סיינטיפיק	F123602G
25 גר' מחט	פישר סיינטיפיק	14-826AA	1 מחט לכל קבוצת מטוש עיניים
3% מי חמצן	פישר סיינטיפיק	S25359
37 ° C אינקובטור	ציוד מעבדה
70% איזופרופנול	פישר סיינטיפיק	PX1840-4
הזרקת Ana-Sed (קסילזין 100 מ"ג/מ"ל)	סנטה קרוז בריאות בעלי חיים	SC-362949Rx
מבער בונזן	ציוד מעבדה
מגבות נייר נקיות	ציוד מעבדה
כותנה מגולגלת / כותנה מגולגלת סטרילית	קורות חיים
קטמין (100 מ"ג/מ"ל)	הנרי שיין	9950001
עכברים	מעבדות ג'קסון	C57/BL6J
צלחות פטרי	פישר סיינטיפיק	08-757-12	לצלחות אגר מלח מניטול
RPI עירוי לב המוח מדיה	פישר סיינטיפיק	50-488525	הכן על פי ההוראות autoclave
SteriFlip (0.22 מיקרומטר גודל נקבוביות, פוליאסטר סולפון)	EMD/Millipore, פישר סיינטיפק	SCGP00525	כדי לעקר את ההרדמה
כלוב עכבר סטרילי	ציוד מעבדה
קימוט שיניים (במבוק עגול)	יסודות המטבח		אוטוקלאבה לפני השימוש והכנת מטוש
טריפטיקזה סויה אגר II עם 5% צלחות דם כבשים	פישר סיינטיפיק	4321261	יש לאחסן ב-4°C עד למוכנות לשימוש
טיפות עיניים לשימוש חד פעמי	בית מרקחת CVS		Bausch and Lomb טיפות עיניים מרגיעות עם חומר סיכה, 28 בקבוקונים, 0.02 אונקיות נוזל כל אחד