מתקן הדמיה נתמך בימוי כבד עכבר להדמיית כלי דם מבוססת מיקרוסקופ מולטיפוטון: טכניקת הדמיה בסיוע מכשיר ייצוב לקבלת תמונות רב-ממדיות של כלי דם בכבד עכבר

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת עכבר

1. הרדמת העכבר
   1. מכינים נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג) במזרק.
   2. תפסו את העכבר (זכר בן 8 שבועות C57BL/6) ביד שמאל כך שבטנו פונה כלפי מעלה וראשו נמוך מזנבו. יש לחטא את עור הבטן ב-75% אלכוהול.
   3. מחזיקים את המזרק ביד ימין, מנקבים את הקו הלבן של הבטן עם המחט מעט לצד ימין של העור ב 3-5 מ"מ. ודא שמחט המזרק והעור נמצאים בזווית של 45 מעלות, הזריק את הפנטוברביטל באיטיות לחלל הבטן. לאחר הגילוח, יש לחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ותמיסת כלורהקסידין.
   4. בדוק אם ההרדמה הצליחה על ידי היעדר רפלקס נכון.
2. הזריקו רודאמין B איזותיוציאנט-דקסטרן לווריד הקאודלי.
   1. הכינו 100 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל רודאמין B איזותיוציאנט-דקסטרן במזרק.
   2. נגבו את זנב העכבר ב-75% אלכוהול.
   3. החזק את הזנב ביד שמאל, החזק את המזרק ביד ימין עם המחט במקביל לווריד, והזריק את הצבע 100 μL.
   4. עצור את הדימום עם צמר גפן לאחר ההזרקה.
3. השרו את פרוות הבטן של העכבר בגזה שהורטבה במים סטריליים, וגלחו את בטנו של העכבר באמצעות סכין גילוח, תוך ביצוע משיכות לכיוון הפרווה. לאחר הגילוח, יש לחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ותמיסת כלורהקסידין.
4. לאחר ניגוב כרית חימום עם 75% אלכוהול, פתחו את כרית החימום והניחו את העכבר על גבו בכרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלו על 37 מעלות צלזיוס.

2. תיקון כבד העכבר עם מסגרת ההדמיה של איברי הגוף

הערה: מסגרת ההדמיה המסחרית של איברים עדיין לא שוחררה.

1. הניחו יניקה נקייה במצב קבוע.
2. התקינו מתקן להדמיית איברים (איור 1) ונגבו את כרית החימום ואת היניקה ב-75% אלכוהול.
3. חברו את היניקה (קוטר 5 מ"מ) לצינור משאבת הוואקום והפעילו את משאבת הוואקום.
4. על שולחן סטרילי מעוקר עם 75% אלכוהול, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ותמיסת כלורהקסידין, לאחר מכן מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ותמיסת כלורהקסידין, ולאחר מכן להשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך 2 ס"מ של עור מגבול החזה התחתון של העכבר ולחשוף את הכבד.
5. הנח את העכבר יחד עם כרית החימום על בסיס המחזיק.
6. התאימו את מתקן ההדמיה של האיברים כך שכוס היניקה תחזיק את הכבד. לאחר מכן השתמשו בלחץ שלילי של 30–35 kPa עבור יניקה, כך שהכבד מתחבר לכוס היניקה (איור 2).

3. התאמת מיקרוסקופ סריקת לייזר מולטיפוטון

1. הפעל את המיקרוסקופ הרב-פוטוני ובחר את המטרה 60x/1.00 W.
2. תקן את המסגרת והעכבר מתחת לעדשת המטרה.
3. הוסיפו טיפה של מי מלח רגילים שיכולים לכסות את כל העדשה, שהיא מרכז היניקה, וכווננו את העדשה האובייקטיבית כך שתיגע רק במי המלח הרגילים.
4. לחץ פעמיים על סמל המחשב כדי להפעיל את תוכנת הלייזר ולהפעיל את המתג. לאחר מכן לחץ לחיצה ממושכת על לחצן ההפעלה והצמצם למשך 3 שניות.
5. הגדר את אורך הגל ל- 800 ננומטר.
6. הפעל את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ באמצעות המחשב.
7. עבור הגדרת הרכישה, הגדר לייזר 800.

איור 1: מסגרת הדמיה של איברי גוף.(א) כרית חימום: היא שומרת על טמפרטורת גוף העכבר. (ב) סוגר: הוא יכול לספק בסיס למיקום העכבר ואת מיקום היניקה המתכווננת עם ידיות. (ג) יניקה: היא קבועה על ידי הסוגר. הלחץ השלילי שמספקת משאבת הלחץ השלילי גורם לכבד להיצמד לעדשה השקופה שבמרכז היניקה. (ד) צינור גמיש: הוא מחבר את היניקה עם משאבת הלחץ. משאבת הלחץ מספקת לחץ שלילי לכוס היניקה. (ה) צינור צנטריפוגה: צינור הצנטריפוגה במרכז הצינור הגמיש יכול להחזיק את הנוזל, כדי למנוע מנוזלים אלה להישאב לתוך משאבת הוואקום. (ו) משאבת לחץ שלילי: היא מחוברת לכוס היניקה באמצעות הצינור הגמיש. משאבת הלחץ השלילי יכולה לספק לחץ שלילי לכוס היניקה כדי לגרום לכבד להיצמד לעדשה.

איור 2: תמונת תקריב של הכבד המחובר לעדשה שקופה.העדשה השקופה נמצאת במרכז היניקה. המשאבה מספקת לחץ שלילי לכוס היניקה כדי לגרום לה למצוץ את הכבד והכבד מחובר לעדשה השקופה. מכיוון שהכבד הפונה ליניקה מרוחק מעט מהעכבר, השפעת הנשימה וקצב הלב על חפצים מופחתת. העדשה השקופה יכולה לספק תצוגה יציבה למיקרוסקופ המולטיפוטון.