זילוח לב מדרדר לנגנדורף: טכניקת Ex Vivo לניקוב לב עכבר מבודד

תקציר

מקור: Wu, K. et al. שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים פרוזדוריים וחדריים מעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה אנו מבצעים זילוח מדרדר לנגנדורף של לב עכבר מבודד. במהלך ההליך, הפעילות הלבבית של הלב נשמרת על ידי ניקוב אותו לאחור עם פתרון זילוח דרך העורקים הכליליים באמצעות צינורית המוחדרת לתוך אבי העורקים העולה. המודל משמש לחקר הפתופיזיולוגיה הלבבית של הלב.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תמיסה ומנגנון זילוח

1. להרכיב מנגנון Langendorff זרימה קבועה (זמין מסחרית או מתוצרת עצמית). איור 1 מספק סכמה פשוטה.
2. הכינו את התמיסות בהתאם לריאגנטים המופיעים בטבלה 1 ובטבלה 2.
3. הפעל את אמבט המים המסתובב והתאם טמפרטורת כניסה מתאימה (42.7 ° C במעבדה שלנו) כדי להבטיח שזרימת מערכת זרימת הדם מהצינורית תגיע ל -37 ° C.
4. נקו את מערכת הזילוח על ידי סירקולציה של מים שעברו דה-יוניזציה. אם נדרש מצב סטרילי, הפעל 75% אתנול דרך מערכת הזילוח במשך 15 דקות, ולאחר מכן מים deionized (לפחות 10 מחזורים כדי למנוע השפעות רעילות אלכוהול על הלב).
5. מדוד את הזמן והנפח עבור מחזור אחד של מערכת זרימת הדם perfusate כדי לקבוע כמה מיליליטר של תמיסת Tyrode מחומצן להיות טעון בשלב הזילוח הבא.
6. לעקר את כל כלי הניתוח בשיטה הרצויה.
7. הגדר את קצב הזרימה של מערכת הזלוף perfusate על 4 מ"ל / דקה.
8. הכינו שתי צלחות פטרי נקיות בקוטר 35 מ"מ – אחת מכילה תמיסה של טירודה (צלחת פטרי 1), השנייה מכילה תמיסה 1 (צלחת פטרי 2).
9. הכינו מזרק 1 מ"ל מלא בתמיסה 1 ומחט צינורית פלדה קהה 20 גרם עם חריץ מהמקום שבו המרחק הוא 1 מ"מ לקצה. מכינים קשר רופף עם תפר 3-0 לפיר הצינורית. לווסת את שדה הצפייה של הסטריאומיקרוסקופ ולוודא שקצה הצינורית נמצא מתחת לפני השטח הנוזליים של צלחת פטרי 2.

2. הכנת בעלי חיים

1. יש לתת הפרין (ריכוז, 1,000 IU/mL; 0.2 מ"ל/עכבר) תוך צפקית לעכברים כדי למנוע קרישי דם. לאחר 10 דקות, מרדימים את העכברים עם נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג, I.P. הזרקה) ולוודא כי העכברים מפסיקים להגיב צביטות זנב / בוהן. ביצוע פריקת צוואר הרחם 20 דקות לאחר מתן הפרין.
2. מעבירים את העכברים למשטח הניתוח, מקבעים את העכברים במצב שכיבה, מעקרים את החזה באתנול 75% ומייבשים אותו בגזה או במפית.

3. כריתת לב וקנולציה של אבי העורקים

1. להרים את העור של xiphoid עם מלקחיים רקמות ולעשות חתך צדדי קטן דרך העור עם מספריים רקמות. לבצע דיסקציה קהה בין העור לבין הפאשיה ולהרחיב את החתך של העור בצורת V לכיוון בית השחי משני הצדדים.
   1. המשך את אותו חתך דרך כלוב הצלעות, ולאחר מכן, להסיט את כלוב הצלעות כלפי מעלה על ידי הידוק עצם החזה עם מלקחיים רקמות כדי לחשוף באופן מלא את הלב והריאות.
2. מקלפים את קרום הלב בעזרת מלקחיים מעוקלים. קרעו את בלוטת התימוס משני הצדדים על ידי שני מלקחיים מעוקלים אם היא מכסה את כלי הדם הגדולים. משכו בעדינות את בסיס הלב לכיוון הזנב בעזרת מלקחיים מעוקלים עד שניתן לראות כלי דם בצורת "Y" (אבי העורקים והעורקים המסועפים שלו).
3. כדי לשמור אורכים שונים של אבי העורקים לצורך קנולציה והשוואה, חצו את אבי העורקים בעורק התרדמה המשותף השמאלי (קו ירוק באיור 2) וחתכו את העורק הברכיוצפלי באותו הזמן אצל עכברים מסוימים. טרנסקט באבי העורקים העולה בעכברים אחרים (קו שחור באיור 2).
   הערה: עבור אלה חדשים בהליך זה, שלב זה יכול להיעשות גם תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
4. הבלו את הלב, ומיד לטבול צלחת פטרי 1 כדי לשטוף ולשאוב את הדם שיורית.
5. מעבירים את הלב לצלוחית פטרי 2 וקוצצים את עודפי הרקמה בעזרת מספריים עדינים של הקשתית במידת הצורך. עבור אלה חדשים בהליך זה, לעשות את השלב הזה תחת סטריאומיקרוסקופ כדי למנוע בטעות חיתוך אבי העורקים או מבני לב אחרים.
6. דוחפים את המזרק כדי לגרש בועות אוויר לפני קנולציית אבי העורקים. בצע קנולציה של אבי העורקים בסיוע שני מלקחיים ישרים (לסתות חלקות) מתחת לסטריאומיקרוסקופ. ודא שכל תהליך הקנולציה נמצא מתחת לפני השטח הנוזליים.
7. הימנעו מחדירה לשסתומי אבי העורקים והתאימו את המעמקים לאבי העורקים העולה (העכבר שאבי העורקים עבר בעורק התרדמה המשותף השמאלי) ולשורש אבי העורקים (העכבר שאבי העורקים עבר בו באבי העורקים העולה), בהתאמה.
   הערה: עומק קנולציית אבי העורקים (המכונה בפשטות עומק) מוגדר כאן כמיקום שבו קצה הצינורית נמצא באבי העורקים או היכן שאבי העורקים קשור.
8. קשרו את אבי העורקים עם תפר 3-0 שקדם לקשר לחריץ הצינורית. לחץ בעדינות על תוכן המזרק כדי לשטוף את הדם השיורי.
   הערה: הדם יעזוב את העורקים הכליליים וישפך מהוורידים הגביים אם העומק ממוקם כראוי. הלב ונספחי הפרוזדורים יתרחבו ויחווירו.
9. מוציאים ומחברים את הצינורית למנגנון לנגנדורף. שוב, יש להקפיד להימנע מבועות אוויר הנכנסות ללב.
   הערה: שים לב כי הזמן מן thoracotomy זילוח ראשוני לא יעלה על 5 דקות.
10. עבור זילוח לב, ראשית, פריים ומחורר חימצן את התמיסה של טירוד במשך כ -10 שניות (נפח הנוזל הפועל 10 שניות במערכת המשמשת בפרוטוקול זה הוא כ 0.7 מ"ל) אם יש שאריות דם באטריה, ולאחר מכן לעבור לתמיסה 1. עם זאת, פשוט לנקב עם פתרון 1 אם אין דם שיורי באטריה. מחוררים את הלב למשך כ-2 דקות.

טבלה 1. פתרונות לבידוד CM עכבר בוגר.

תמיסה	תוכן (ריכוז סופי ב-mmol / L, אם לא צוין אחרת)	ציין
פתרון זילוח (פתרון 1)	113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 טאורין, 5 גלוקוז, 10 2,3-בוטנדיון מונוקסים(BDM)	אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 °C (75 °F). גלוקוז, טאורין ו- BDM מתווספים ביום הניסוי. הכינו 200 מ"ל של תמיסת זילוח לכל לב.
הפתרון של Tyrode (פתרון 2)	140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 גלוקוז	אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 ° C. CaCl2 וגלוקוז מתווספים ביום הניסוי, להתאים pH ל 7.3-7.4 עם NaOH רווי בטמפרטורת החדר (28-30 מעלות צלזיוס) עם מד PH.

טבלה 2. פתרונות לבידוד ואחסון CM עכבר בוגר.

תמיסה	תוכן	ציין
פתרון עיכול (פתרון 3)	25 מ"ל תמיסה 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg collagenase II, 50μL (2.5% 10×) טריפסין	לכל לב
עצור פתרון 1(פתרון 4)	9 מ"ל תמיסה 1, 1 מ"ל FBS (סרום בקר עוברי), 4μL 100 מ"ל CaCl2	לכל לב
עצור פתרון 2(פתרון 5)	9.5 מ"ל תמיסה 1, 0.5 מ"ל FBS (סרום בקר עוברי), 4μL 100 mM/L CaCl2	לכל לב
פתרון תרחיף תאים(פתרון 6)	תמיסה 13 מ"ל 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (אלבומין בסרום שור) במינון שיכול ליצור שכבה דקה המכסה את פני השטח של הנוזל	לכל לב

תוצאות

איור 1. דיאגרמה סכמטית של מערכת לנגנדורף שהורכבה שונה.מערכת זו חסכונית וניידת עבור המשתמשים. יש לו שני חלקים של צינורות פלסטיק - אחד למים (קוטר פנימי, 8 מ"מ) ואחד לפרפוזט (קוטר פנימי, 1.5 מ"מ) - מתוכם הקצה הדיסטלי מחובר לסטופקוק תלת-כיווני רפואי PE עם מנעול Luer. בקבוק זכוכית המכיל מים ועם פקק גומי נוצר כמחליף חום. הפרבוסט נשאב לתוך צינורות הפלסטיק במחליף החום על ידי המשאבה הפריסטלטית...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2,3-בוטנדיון מונוקסיום (BDM)	סיגמא-אולדריץ'	31550
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C4901
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G7528
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375
KCl	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9333
KH2PO4	סיגמא-אולדריץ'	P5655
KHCO3	סיגמא-אולדריץ'	237205
MgCl2	סיגמא-אולדריץ'	M8266
מגסו4	סיגמא-אולדריץ'	M7506
נא2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	S7907
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S7653
NaHCO3	סיגמא-אולדריץ'	S5761
משאבה פריסטלטית	משאבה ארוכה יותר	BT100-2J
טאורין	סיגמא-אולדריץ'	T0625
אמבט מים	ג'ולאבו	אד (v.2)