$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. הכנת תמיסת צבע כחול מתילן
- יש למדוד 0.1 גרם אבקת מתילן כחולה.
- ממיסים את המתילן הכחול במי מלח רגילים של 10 מ"ל או במי מלח חוצצים של פוספט (PBS) לחלוטין על ידי מערבולת.
- סנן את תמיסה 10 מ"ג / מ"ל מתילן כחול עם מסנן מזרק (גודל נקבוביות הממברנה 0.45μm) כדי למנוע סתימה במהלך ההזרקה.
- הרכיבו סט ורידים סטרילי לקרקפת (27 גרם x 3/4 אינץ') עם מזרק חד פעמי 3 מ"ל ומלאו את המזרק בתמיסת מתילן כחולה מסוננת 3 מ"ל.
הערה: כדי למנוע לחץ הידרוסטטי וזרימת צבע לאחר מכן, הניחו את קצה המחט מעל המזרק המלא בתמיסת מתילן כחולה.
2. דיסקציה של עוברים טרום לידתיים
- ניקוי מספריים ומלקחיים עם 70% אתנול.
- כדי לאסוף עוברים פרינטליים ב- E18.5 או E19.5, יש להרדים עכברות הרות תחילה באמצעות שאיפתCO2 ולאחר מכן לבצע נקע צוואר הרחם בהתאם להנחיות NIH.
הערה: נקבת העכבר ההרה בדרך כלל יולדת החל מ-E18.5, עם זאת, כליות גדולות יותר קלות יותר למניפולציה. לכן, כליות ב E19.5 קרוב יותר ללידה קל יותר לבצע ניתוח זה. עם זאת, גורים עם חסימות בדרכי השתן דו צדדיות מתים לאחר הלידה. בהתאם למאפיינים של עכברי ניסוי, יש לקבוע אמפירית יום/שעה מתאימים לאיסוף.
- יש לרסס אתנול 70% על משטח הבטן הגחוני ולאחר מכן לפתוח את חלל הבטן באופן גחוני באמצעות מספריים ומלקחיים.
- הרימו את הרחם כולו והפרידו מהגוף על ידי חיתוך במספריים מנתחים בקצות קרני הרחם.
- שטפו את כל הרחם עם 1x PBS בצלחת פטרי.
- חותכים את הרחם באופן סגמנטאלי עם מספריים מנתחים ומסירים שליה עם מלקחיים מנתחים כדי לחשוף את העוברים בשקי חלמון.
- הסר תחילה את שק החלמון ולאחר מכן הסר את קרום מי השפיר עם מלקחיים מנתחים כדי לשחרר את העוברים סביב הלידה.
- ערפו את ראשו של עובר בעזרת מספריים מנתחים. נגבו עודפי דם עם רפידות גזה סטריליות. הצמידו את העובר עם משטח הגחון שלו למעלה במיקרוסקופ מנתח המצויד במצלמה דיגיטלית להדמיה. לאסוף את זנבו לגנוטיפ במידת הצורך.
הערה: לבצע זריקות עובר אחד בכל פעם.
- בזהירות לפתוח את חלל הבטן של עובר עם מלקחיים על ידי קריעת העור. לאחר מכן, הסירו בזהירות איברים ורקמות עודפים כמו כבד, קיבה ומעי באמצעות מלקחיים על-ידי חיתוך שלהם או משיכתם החוצה כדי לחשוף את הכליות, השופכנים ושלפוחית השתן שנמצאים באופן גבי (איור 1A). לספוג עודפי דם מהעובר שנותח עם רפידות גזה סטריליות במידת הצורך.
הערה: עודף דם מפריע לזיהוי אגן הכליה להזרקת הצבע.
3. הזרקת צבע כחול מתילן לאגן הכליה וניטור זרימת הצבע
- הסר בועות במחט ובצינור על ידי הוצאת תמיסה כחולה מתילן מקצה המחט על ידי לחץ הידרוסטטי. הרימו את המזרק המכיל את תמיסת הצבע מעל גובה קצה המחט כדי להתחיל לזרום, ולאחר מכן הורידו את המזרק כדי לעצור את הזרימה.
- הכנס את המחט לאגן הכליה ליד השופכן הפרוקסימלי, תוך הקפדה שלא להפריע לו לאחר הנחתו. בצע הזרקת צבע לכליה כדי לקבוע את חסימת דרכי השתן שלה.
הערה: בצע הזרקת צבע לכל כליה חריגה, ראשית, על ידי ביצוע אותה הדרך כדי לקבוע את חסימת דרכי השתן שלה.
- הרימו את המזרק כ-20 ס"מ כדי לספק לחץ הידרוסטטי ותנו ל-15 μL-60 μL של תמיסת הצבע לזרום. קצב הזרימה יהיה כ-3 מיקרוליטר/שנייה אם המזרק מורם לגובה זה מעל העובר.
- עקוב אחר הצבע הכחול של הצבע החל תחילה באגן הכליה, לאחר מכן באורך השופכן, ולבסוף בלומן שלפוחית השתן.
הערה: לוקח בערך 5 שניות לראות צבע חלש מופיע בתוך לומן שלפוחית השתן אם השופכן מוכנס כראוי לתוך שלפוחית השתן. תנו לצבע להצטבר באתר החסום כ-15 שניות אם לא מופיע צבע בלומן של שלפוחית השתן.
- מניחים את המזרק למטה כדי לעצור את זרימת הצבע ולהסיר את המחט מהכליה.
- צלם תמונות של הכליה, השופכן ושלפוחית השתן במעקב אחר תמיסת צבע באמצעות המצלמה ותוכנת ההדמיה המחוברת לסטריאומיקרוסקופ.
- רשום את ההידרונפרוזיס של הכליה, ההידרואורטר ואת המיקום הסופי של תמיסת הצבע במחשב מחברת מעבדה.
- לבצע הזרקה של הכליה הנגדית כמתואר בשלב 3.1 עד 3.5 ולאפשר זרימת צבע כ 20 s בסך הכל.
הערה: לומן שלפוחית השתן יהיה מלא בתמיסת צבע, המסומנת בצבע כחול חזק, אם השופכן מוכנס כראוי לתוך לומן שלפוחית השתן. לאחר הערכה של חסימת צומת בדרכי השתן, ניתן לקבע את השופכנים ואת שלפוחית השתן לחתך.
