מאמר שיטה

בידוד ביציות אנטראליות של עכבר: שיטה לבידוד ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Monti, M. et al. בידוד ואפיון ביציות אנטראליות בעכבר על בסיס ארגון כרומטין גרעין. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מתאר את הבידוד של ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו. ביציות אנטראליות אלה יכולות לשמש לאפיון נוסף ולמחקרים התפתחותיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בעלי חיים

  1. החזיקו נקבות עכברים בוגרות בנות 3 עד 6 שבועות בחדר עם טמפרטורה ולחות מבוקרות (עם שלבים של 12L:12D והוזנו אד ליביטום).
  2. הזריקו לעכברים תוך צפקית 2.5 IU של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) כדי לעורר צמיחת זקיקים על ידי חיקוי ההשפעות של הורמון מגרה זקיק (FSH). בודד את השחלות עבור איסוף ביציות antral 48 שעות מאוחר יותר. הרדימו את נקבת העכבר שהוזרקה בעבר עם PMSG, בהתאם להנחיות הסטנדרטיות.
  3. הוציאו במהירות את השחלות מחלל הגוף והכניסו אותן לצלחת פטרי המכילה מדיום M2 לבידוד הביציות הבאות (ראה סעיף 3).
    1. בצע חתך על העור המכסה את דופן הבטן ואחריו חתך בצפק באמצעות מספריים דיסקציה סטרילית. פתח את החתך כדי לחשוף את הבטן, להזיז את המעיים בצד אחד באמצעות פינצטה סטרילית ולמקם את צינורות הרחם, יצירת צורת V החל משלפוחית השתן.
    2. שימו לב לשחלות הממוקמות מתחת לכליות. החזיקו כל צינור בפינצטה סטרילית ובצעו חתך קטן בתחתית השחלות כדי לשחרר אותן. מעבירים את שתי השחלות בתחתית צלחת פטרי המכילה תווך מאוזן מראש.

2. הכנת הורמונים

  1. מדלל PMSG (זמין בריכוזי מלאי שונים) עם תמיסת מלח איזוטונית סטרילית לקבלת ריכוז עבודה של 2.5 IU הורמון לכל 0.1 מ"ל עבור נפח הזרקה מתאים.
    הערה: פתרונות הורמונליים חייב להיות aliquoted בצינורות 0.5 מ"ל ומאוחסן ב -20 °C ( 20 °F) עד יום השימוש. אין לשמור aliquots מדולל יותר משלושה חודשים ב -20 ° C. לאחר ההפשרה, אם זריקות סדרתיות מבוצעות, לאחסן את aliquots של פתרונות הורמונליים ב +4 ° C ולהשתמש בהם בתוך 4 ימים.

3. בידוד ביציות אנטראליות

לבידוד ביציות תקין:

  1. יש לאזן את M2 בינוני (M2) ב-5% CO2 ו-37°C למשך שעה לפחות לפני תחילת הליך בידוד הביציות. הכינו שתי צלחות פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ), אחת עם 1 מ"ל M2 לניקוב השחלה והשנייה עם טיפות קטנות (20 מיקרוליטר) של M2 מכוסה בשמן מינרלי (~1.5 מ"ל) להעברת ביציות לאחר בידוד מהשחלה (ראו שלבים 3.4–3.6). שמרו את שתי צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 5%CO2 ו-37°C עד שהן מוכנות לשימוש.
  2. השתמש בסטריאומיקרוסקופ במהלך הליכי בידוד ביציות.
  3. הכינו פיפטות זכוכית דקות בפה כדי לאסוף את הביציות על-ידי מתיחה של פיפטות פסטר מזכוכית המוחזקות אופקית (מחזיקות את קצות הפיפטה בשתי הידיים), מעל להבה אנכית שמגיעה ממבער הבונזן (איור 1).
    1. ברגע שהזכוכית מתחילה להימס, הוציאו את הפיפט מהלהבה, ובצעו תנועת משיכה מהירה כדי להשיג את הפיפט הרצוי. חותכים היטב את עודפי הזכוכית קרוב לנקודה הצרה של פיפטה עם ציפורניים כדי להתאים את אורך וקוטר הנימים הפנימיים. ודא כי נימי דק יש קוטר פנימי של ~ 100 מיקרומטר, מעט גדול יותר מקוטר הביצית (~ 80 מיקרומטר).
    2. כדי פיפטת הפה, חבר קצה אחד של צינור השואף לפיפטה הנמשכת באמצעות קצה מתאים ומקם את הקצה השני בפה, מאבטח אותו עם השיניים.
  4. אספו את השחלות באמצעות פינצטה סטרילית והפקידו אותן בתחתית צלחת פטרי תרבית תאים (35 מ"מ על 10 מ"מ). כסו אותם ב-1 מ"ל של M2 שקודם לכן היה שווה משקל של 37°C ו-5% CO2 (איור 2).
  5. נקבו בעדינות את הזקיקים האנטראליים של השחלות באמצעות מחט מזרק אינסולין סטרילית כדי לשחרר ביציות אנטראליות ב-M2 (איור 3).
  6. העבירו את הביציות בעדינות דרך פיפטת פסטר צרה כדי להסיר תאי זקיק וכל פסולת רקמה אפשרית אחרת (איור 4A) ולאחר מכן ליישב אותן בתחתית טיפות קטנות (20 מיקרוליטר) של M2 המכוסות בשמן מינרלי המתאים לתרבית עוברים (שהוכנו בעבר; איור 4B).
    הערה: חשוב להסיר את כל תאי הקומולוס המחוברים לזונה פלוצ'ידה של הביציות על ידי צנרת רציפה דרך מספר טיפות שונות של M2. בצע שלב זה מהר ככל האפשר כדי למנוע שינויים ב- pH של המדיום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. הכנת פיפטה בפה באמצעות פיפטות פסטר זכוכית ומבער בונזן.

figure-results-2
איור 2. שחלות שלמות בצלוחית פטרי מלאה בתווך M2 שחומם מראש ומאוזן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PMSGסיגמאG4527
EmbrioMax M2מיליפורMR-015-PD
שמן מינרליסיגמאM8410
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ x 10 מ"מקורנינג430165
צלחת μ 35 מ"מ, תחתית זכוכית גבוההאיבידי81158
פיפטה פסטר בורוסיליקטקורנינג7095D-9
מכלולי צינור אספירטור עבור פיפטות מיקרופילריות מכוילותסיגמאA5177

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

M2

מאמרים קשורים